Wektory DNA

Wektor to cząsteczka DNA, która może być nośnikiem fragmentu DNA i posiadająca w danym rodzaju komórek zdolność autonomicznej replikacji. Zapewnia ona powielanie się wprowadzanego fragmentu DNA, czyli jego klonowanie, a czasem też wydajną syntezę białka kodowanego przez ten gen (czyli transkrypcję oraz translację, a także jego stabilność) tak, jak to następuje w wypadku tzw. wektorów ekspresyjnych. Istnieje kilka typów wektorów, a dobranie właściwego zależy głównie od tego, w jakiej komórce zamierzamy dany gen klonować. Najważniejszy element warunkujący specyficzność wektora to sekwencje odpowiedzialne za rozpoczęcie replikacji zwane sekwencjami ori. Najprostsze wektory posiadają tylko jedno miejsce restrykcyjne, w które można wprowadzać obce DNA. Najczęściej wykorzystywane są jednak tzw. polilinkery - syntetyczne odcinki DNA, w których istnieje zwykle kilka lub kilkanaście miejsc, które rozpoznają różne restryktazy.

Pozwala to swobodniej dobierać odpowiednie wektory do klonowania danego enzymu. Wektory posiadają także zazwyczaj geny markerowe, kodujące proteiny odpowiedzialne za cechy fenotypowe, które są łatwo wyróżnialne. Wektor musi być skonstruowany w taki sposób, aby była możliwość oddzielenia komórek, do wnętrza których wniknął od komórek pozostałych. Budowa wektora powinna także pozwalać na odróżnienie zrekombinowanego wektora od tego, który był zdolny zamknąć się z DNA bez ligacji.

PLAZMIDOWE WEKTORY BAKTERYJNE

To cząsteczki DNA nieduże i koliste. Zawierają miejsce ori replikacji, geny markera selekcyjnego (przeważnie gen oporności na antybiotyk), a także pozycję do klonowania.

Wektory plazmidowe są wprowadzane do wnętrza komórek bakterii dzięki zjawisku transformacji. U najczęściej stosowanej bakterii, Escherichia coli, proces ten wymaga zwiększenia przepuszczalności jej błon komórkowych. W tym celu komórki wystawia się na działanie wysokiej koncentracji pewnych kationów dwuwartościowych. Typowa procedura zakłada traktowanie komórek roztworem CaCl₂ (chlorku wapnia). Transformacji ulega przeważnie tylko 1 kom. na milion. Na każdy tysiąc plazmidów poddanych rekombinacji tylko jedna cząsteczka powoduje transformację komórki bakteryjnej. Każda zdolna do tego komórka inkorporuje zaledwie jeden plazmid. Do przeprowadzania selekcji zazwyczaj używa się dwóch sposobów. Pierwszym z nich jest umiejscowienie w plazmidzie 2 genów oporności, z których każdy odpowiada za oporność na inny antybiotyk, przy czym jeden z nich posiada fragment do klonowania. Komórka, która plazmidu nie pobrała będzie wykazywała wrażliwość na oba antybiotyki. Ta, która pobrała niezrekombinowany plazmid będzie na oba oporna, zaś komórka, która pobrała plazmid zawierający fragmentem obcego materiału genetycznego będzie przejawiała wrażliwość na ten antybiotyk, w genie którego znajdowało się miejsce restrykcyjne, gdyż zostanie przerwana ciągłość genu, co spowoduje, że produkowane białko nie będzie czynne biologicznie. Drugim sposobem jest system selekcji oparty o tzw. test alfa-komplementacji. Polilinkery większości wektorów są umiejscowione w obrębie genu kodującego enzym β-galaktozydazę. Transformacji podlegają bakterie, które posiadają mutację we fragmencie genomu kodującym tą właśnie część enzymu. Umożliwia to dokonanie na odpowiednio przygotowanej pożywce selekcji bakterii, które pobrały zrekombinowany plazmid, gdyż tylko one zabarwione będą na biało. Te bakterie, u których doszło do komplementacji mutacji enzym jest sprawny i rozkłada dodany do pożywki substrat, co powoduje, że taka kolonia przybiera niebieskie zabarwienie.

Pojedyncze bakterie utworzą kolonie, a w kolonii wszystkie plazmidy będą pochodziły z jednego plazmidu, który został wprowadzony do komórki założycielskiej tej kolonii. Dochodzi więc do powstania klonu, zaś fragment DNA w plazmidzie to sklonowane DNA.

Pojemność plazmidowych wektorów ograniczona jest przez sposób wprowadzania rekombinacyjnych fragmentów materiału genetycznego do poszczególnych komórek gospodarza. Przy transformacji klasycznej wielkość może wynosić ok. 10 kb. Należy zwrócić także uwagę na krotność kopii wektora w danej komórce. Wyróżnia się wektory wysokokopijne i niskokopijne, co jest uzależnione od rodzaju ich ori.

Klonowanie polega w przypadku wektorów plazmidowych na przecięciu fragmentu DNA będącego wektorem odpowiednimi enzymem restrykcyjnym, defosforylacji końców wektora w celu eliminacji możliwości powrotu samego wektora do kształtu kolistego oraz ligacji za pomocą ligazy DNA. Tworzy ona standardowe wiązania fosfodiestrowe z przygotowanymi odpowiednio wcześniej fragmentami DNA, które pragniemy sklonować. Są one pocięte przy pomocy tej samej restryktazy lub dającej komplementarne końce.

WEKTORY - POCHODNE BAKTERIOFAGÓW :

LAMBDOWE

Można klonować w nich dość duże fragmenty DNA. Inną ich zaletą jest duża wydajność infekowania cząstkami bakteriofagów, która jest wyższa niż wydajności transformacji.

Budowa: odpowiednio zmodyfikowany bakteriofag l. Wprowadzone w pewnych genach mutacje punktowe zmieniają właściwości produktów, jak np. krótkie delecje, a czasem usunięcie środkowego fragmentu DNA, który jest odpowiedzialny za cykl lizogenny. Z DNA faga usunąć można ok. 30% genomu, pozostawiając jedynie jego prawe i lewe ramię, które zawierają wszystkie niezbędne geny cyklu litycznego. Dzięki 12 wzajemnie komplementarnym nukleotydowym, jednoniciowym cząstkom materiału genetycznego na końcach DNA faga (tzw. sekwencje "cos") jest możliwe przybranie w kom. bakteryjnej przez DNA faga formy kolistej, a także zapakowanie tego DNA w główkę białkową bakteriofaga. Także w tych wektorach znajdują się polilinkery, silne promotory, geny markerowe i inne.

Wyróżnia się dwa rodzaje lambdowych wektorów, co jest spowodowane tym, że do główki bakteriofaga może być pakowane DNA o długości 75% - 105% dł. DNA dzikiego typu faga. Rodzaje wektorów lambdowych:

• replacement - są skonstruowane w taki sposób, że region centralny jest oflankowany przez identyczny zestaw miejsc restrykcyjnych w taki sposób, że po przecięciu daną restryktazą wycinany jest z wektora ten region; w jego miejsce może zostać wstawione obce DNA o dł. 9-25 kb; klonowanie polega na izolowaniu regionu centralnego po wycięciu poszczególnych ramion oraz na łączeniu z fragmentami zdefosforylowanymi obcego DNA (uniemożliwia to wstawienie 2 różnych fragmentów DNA do wnętrza jednego wektora) w odpowiednich warunkach na tworzeniu konkatamerów, a następnie pakowaniu w kapsydy faga in vitro oraz infekcji komórek Escherichia coli;
• insercyjne - zawierają jedynie niewielkie modyfikacje genomu dzikiego faga; fragment obcego DNA zawierać się musi w granicach 0 - 8 kb; klonowanie opiera się na przecięciu DNA właściwym enzymem restrykcyjnym w miejscu odpowiednim do klonowania, a później na izolacji kolejnych ramion oraz ligacji z cząsteczką DNA w takich warunkach, które umożliwiają tworzenie konkatamerów, pakowanie w kapsyd faga oraz infekcję E. coli; wprowadzanie wektorów do kom. gospodarza odznacza się wysoką efektywnością - najczęściej jedna na 20 cząsteczek wektora zrekombinowanego jest pakowana efektywnie w kapsyd, a następnie wprowadzana do kom. E. coli.

POCHODNA FAGA TYPU M13

Posiada szczególny cykl pozwalający na jego wykorzystanie do wytwarzania DNA jednoniciowego, co jest przydatne przy sekwencjonowaniu DNA albo ukierunkowanej mutagenezie.

KOSMIDOWE

Są one stosowane w klonowaniu dużych odcinków DNA, takich jak operony prokariotyczne czy geny eukariotyczne. Są to pod względem budowy zmodyfikowane plazmidy, które zawierają sekwencję "cos" faga l, która jest konieczna do pakowania DNA do wnętrza kapsydów fagowych. Najprostsze z nich zawierają miejsce "ori" repilkacji, a także gen selekcyjnego markera, miejsce klonowania i sekwencję "cos". Tego typu modyfikacje wektorów opierają się na zwiększaniu liczby miejsc klonowania (powstają tzw. polilinkery), wprowadzaniu elementów, które umożliwiają analizę klonowanego fragmentu DNA, jak np. promotory fagów T3 i T7. Jest to także oparte na wprowadzeniu elementów, które umożliwiają działanie wektora w kom. eukariotycznych (ori eukariotyczne), genu markera selekcyjnego komórek eukariotycznych, a także na wprowadzeniu drugiej sekwencji "cos".

Wprowadzanie zrekombinowanych cz. wektora podobne jest do typowej infekcji fagowej. Materiał DNA wektora złączonego z odpowiednio dużym fragmentem obcego DNA pakowany jest poza ustrojem do kapsydu faga, a później jest w drodze transdukcji wprowadzany do wnętrza komórek gospodarza. Kosmidy działają tam jak plazmidy.

Pojemność wektora jest oczywiście ograniczona. Klonowany DNA może mieć wielkość 35 - 45 kb, gdyż DNA wprowadzony do kapsydu musi mieć wielkość od 38 do 52 kb. W procesie pakowania musi więc powstać układ 2 sekwencji "cos" w jednym fragmencie DNA, które będą od siebie oddalone o 38 - 52 kb. Aby to osiągnąć trzeba ciąć wektor przy pomocy odpowiedniej restryktazy i defosforylowany łączyć z fragmentami obcego materiału DNA o odpowiedniej wielkości, przy dużym stężeniu DNA oraz odpowiednio dużym nadmiarze wektora, co sprzyja tworzeniu się konkatamerów. Gdy w wektorze zawarte są dwie sekwencje "cos", można też rozcinać go w 2 miejscach: miejscu klonowania oraz między sekwencjami "cos", następnie łączyć go z cząsteczkami obcego, zdefosforylowanego DNA z jednoczesnym wysokim stężeniem ATP. Powoduje to, że ligacja tępych końców jest mało wydajna, a głównym produktem w tej reakcji jest obce DNA połączone z częściami wektora.

WEKTORY DROŻDŻOWE

Drożdże posiadają wiele zalet jako kom. gospodarzy: mają one struktury typowe dla kom. eukariota, a geny które się w nich klonuje zawierać mogą sekwencje intronowe. Proces przeprowadzany przy obróbce mRNA jest bliski temu, który występuje u wyżej uorganizowanych eukariontów, a białka drożdży podlegają posttranslacyjnym modyfikacjom. Z tego wynika, że DNA należy klonować w drożdżach wtedy, gdy ważne jest uzyskanie ekspresji genu wykorzystywanego w badaniach. Są 2 typy wektorów drożdżowych: replikatywne to takie, których ori pochodzi od chromosomów drożdży (sekwencja ars) lub też episomalne, których ori pochodzi od specyficznego plazmidu, który naturalnie występuje u drożdży.

Wektory posiadają poza tym polilinkery oraz geny markerowe.

Wektory te mogą być wahadłowe (bifunkcjonalne), które mają odrębne miejsca startu replikacji oraz geny markerowe, dzięki czemu możliwe jest np. klonowanie genów wewnątrz komórek bakteryjnych, zaś badanie ekspresji tych genów w drożdżach.

Zostały również skonstruowane sztuczne drożdżowe chromosomy, tzw. YAC. Można w nich klonować bardzo duże fragmenty DNA, nawet do 500 kb. Chromosom YAC posiada sekwencje umożliwiające replikację chromosomów naturalnych zwanych ars, a także zapewniają podczas podziału segregację na sekwencje centromerowe i telomerowe. Znajdują się tam ponadto polilinkery i geny markerowe.

INNE TYPY WEKTORÓW

POCHODNE WIRUSA typu SV40 (Simian Virus)

Budują je fragment 500 bp DNA wirusa, który zawiera ori, promotory genów, które kodują wczesne białka wirusowe oraz sekwencje regulacyjne, które odpowiedzialne są za aktywację transkrypcji. Ten typ używany jest do klonowania przede wszystkim w komórkach ssaków.

POCHODNE RETROWIRUSÓW

Są one stosowane w tzw. złożonych bezpiecznych układach. Pierwszym ich składnikiem jest dwuniciowy DNA zawierający sekwencje zwane LTR (ang. long terminal repeats - pl. długie powtórzenia końcowe), pełniące funkcje promotorów dla genów wirusa oraz niezbędne do integracji wirusowego DNA z materiałem genetycznym gospodarza, a także z tzw. sekwencji psi, która warunkuje układanie kw. nukleinowego we wnętrzu kapsydu. Drugim składnikiem jest linia komórek połączonych z prowirusem, który pozbawiony jest sekwencji psi, posiada za to geny, które kodują białka otoczki wirusa oraz odwrotną transkryptazę. W komórkach ssaków klonowanie przeprowadzane jest w taki sposób, że materiał DNA retrowirusa wraz z obcym genem do niego włączonym wprowadzany jest do specyficznej linii komórkowej, gdzie produkt transkrypcji jest pakowany w otoczki białkowe, które się izoluje i przy ich pomocy infekuje się komórki docelowe. Dochodzi do przepisania RNA do DNA, który jest włączany do chromosomu. Daje to początek linii komórkowej transformowanej.

POCHODNE BAKULOWIRUSÓW

Wektory te skonstruowane zostały z bakteryjnych sekwencji ori, genu oporności antybiotykowej oraz kasety ekspresyjnej, którą budują polilinker oraz genowe sekwencje regulacyjne polihedryny bakulowirusa (promotor oraz terminator). Transfekowane są komórki owadów lub ich larwy. Wykorzystywana jest do tego mieszania DNA bakulowirusa oraz zlinearyzowany wektor niosący zrekombinowany gen markerowy, który umożliwia w kom. owadów selekcję. W komórce dochodzi do homologicznej rekombinacji oraz do utworzenia wirusa zrekombinowanego, który w miejsce genu polihedryny posiada gen, który wybraliśmy do sklonowania. Dochodzi do prawidłowych posttranslacyjnych modyfikacji klonowanych białek. Produkcja prowadzona w ten sposób ma zbyt niską wydajność, a koszt jest zbyt wysoki, by ten sposób był często wykorzystywany. Znajduje on zastosowanie w wytwarzaniu wybranych leków oraz odczynników diagnostycznych i analitycznych.

POCHODNE ADENOWIRUSÓW

W ich cyklu rozwojowym dochodzi do wprowadzenia do komórki wielu kopii materiału DNA. Informacja genetyczna podlega ekspresji, nie dochodzi jednak do replikacji, gdyż DNA adenowirusa nie zostaje włączone w DNA komórki gospodarza. Wprowadzanego DNA mniej jest z pokolenia na pokolenie. Wprowadzane do niego odcinki DNA muszą być dość krótkie. Najczęściej stosowany jest do klonowania w kom. ssaków.

WEKTORY EKSPRESYJNE

Posiadają one odpowiednio umiejscowiony silny promotor, który umożliwia im ekspresję białka, gen którego na wektorze tym znajduje się.

1. Wektory plazmidowe ekspresyjne - zawierają one regulowane, silne promotory. Taki promotor sprawia, że w odpowiednich warunkach transkrypcja inicjowana jest wiele razy w ciągu minuty. Np.: promotor laktozowy. Wzmaganie transkrypcji osiąga się przez dodanie analogu laktozy (IPTG) do pożywki.

2. Wektory plazmidowe ekspresyjne, które zawierają sekwencję promotorową późnych protein faga T7. Promotor genu polimerazy RNA faga T7 jest specyficzną sekwencją złożoną z 23 bp. Ten system jest skomplikowany i składają się na niego 2 elementy. W zrekombinowanych kom. E. coli, które zawierają gen kodujący polimerazę RNA wstawiony po promotorze laktozowym dochodzi do syntezy dużych ilości polimerazy RNA, kiedy doda się do pożywki IPTG. Dochodzi do transformowania tych komórek wektorem plazmidowym, niosącym powielony promotor T7 oraz cDNA genu, który koduje wybrane białko. Polimeraza RNA ulega przyłączeniu do promotora T7 na plazmidowym wektorze. Reakcja ta katalizuje transkrypcję włączonego cDNA.

3. Systemy ekspresyjne eukariota. Bardzo ważny system, szczególnie gdy wymagane jest otrzymanie aktywnego białka, w którym modyfikacje posttranslacyjne są prawidłowo przeprowadzone.

Maksymalne wielkości DNA, który mogą klonować poszczególne wektory.

Rodzaj wektora	Dł. klonowanego DNA (kb)
Plazmid	10
Bakteriofag	25
Kosmid	45
YAC	500