Pierwszym eksperymentem z udziałem rekombinowanego DNA było wyprodukowanie somatostatyny. Jest to peptyd zbudowany z 14 aminokwasów, występujący w organizmie ludzi. Gen, który koduje somatostatynę zsyntetyzowano wykorzystując do tego celu dostępne techniki chemiczne, a następnie wklonowano do wektora - eksprymowanego plazmidu pochodzącego z komórek bakterii Escherichia coli. Natomiast pierwszym komercjalnym produktem jest insulina.

W dzisiejszych czasach rozwój technik rekombinacji DNA pozwala na wytwarzanie i stosowanie w praktyce medycznej wielu białek bardzo pomocnych w leczeniu chorób takich jak: nowotwory, różnego rodzaju alergie, chorób o podłożu autoimmunologicznym, schorzeń neurologicznych, genetycznych, zwykłych infekcji bakteryjnych czy wirusowych, ataków serca, chorób krwi.

W momencie, kiedy naukowcy, dzięki rekombinacji DNA zyskali możliwość wprowadzania do białek niewielkich modyfikacji, które w znacznym stopniu usprawniają ich funkcjonowanie oraz zwiększają użyteczność, pojawiło się zupełnie inne podejście do metod produkcji leków. i.

Technologię oraz metody wykorzystywane w inżynierii genetycznej znalazły zastosowanie w procesach produkcji:

- wielu enzymów,

- biologicznie aktywnych białek takich jak interferon lub czynniki, biorące udział w krzepnięciu krwi,

- antybiotyków m.in. penicyliny oraz streptomycyny,

- związków spełniających w organizmie funkcję hormonów - somatostatyny, somatotropiny, czy insuliny.

Oprócz tego omawiane techniki mają zastosowanie w:

- tworzeniu map chromosomowych,

- badaniu mutacji punktowych w takich schorzeniach jak: fenyloketonuria, beta-talasemia, czy dystrofia mięśniowa Duchenne`a,

- detekcji submikroskopowych mutacji typu insercji, delecji, czy translokacji,

- badaniu profili RFLP między innymi w takich przypadkach jak koagulopata oraz mukowiscydoza.

RFLP to technika bazująca na polimorfizmie długości fragmentów restrykcyjnych (Restriction Fragment Lengh Polimorfizm). Genomy u poszczególnych osób są między sobą zróżnicowane czyli mówimy, że występuje między nimi polimorfizm genetyczny. Fragmenty DNA otrzymywane po ich inkubacji z enzymami restrykcyjnymi są swoiste dla każdego z genomów. W przypadku pewnych chorób udało się znaleźć korelację zachodzącą między mutacją powodującą wypadnięcie lub powstanie nowego miejsca rozpoznawanego przez restryktazę, a określoną chorobą.

ZASTOSOWANIE TECHNIK INŻYNIERII GENETYCZNEJ W MEDYCYNIE ORAZ FARMACJI.

  1. ZAPOBIEGANIE.

Szczepionki nowej generacji, a walka z infekcjami:

W tego typu szczepionkach znajdują się żywe, ale atenuowane (osłabione) mikroorganizmy (atenuacja w tym przypadku polega na wprowadzenie do ich genomów precyzyjnie określonych mutacji typu delecji).

Stosuje się je np. w celu zapobiegania zakażeniom powodowanym przez bakterię Salmonella typhi wywołującą dur brzuszny.

Kolejnym przykładem są szczepionki podjednostkowe, w których stosuje się:

  • białka rekombinacyjne - są one syntetyzowane w komórkach organizmu, do których wprowadzono geny kodujące immunogenne białka patogenu, niesione przez wektor jakim jest wirus,
  • białka syntetyczne.

Przykładami mogą tu być:

  • nowoczesna szczepionka przeciwkrztuścowa,
  • wprowadzanie odcinka genu, niosącego informację o immunogennych właściwościach toksyny produkowanej przez Clostridium tetani (bakterii powodującej tężec), wkolonowanego do komórek Escherichia coli,
  • szczepionka przeciw wirusowej żółtaczce typu B, wytwarzana przez komórki drożdży, wykazujące ekspresję antygenów, znajdujących się na powierzchni otoczek wirusowych - gen immunogennych białek został wprowadzony do wysokokopijnego wektora niesionego przez komórki drożdży, dzięki czemu białko wirusowe jest wytwarzane w znacznych ilościach.

Szczepionki trzeciej generacji czyli profilaktyka genowa, polega na wprowadzaniu do organizmu czystego genu. Szczepionki te często określa się mianem "nagich".

Jako przykład można tu wymienić:

  • wstrzyknięcie do komórek mięśni szkieletowych cząsteczek kwasu nukleinowego wirusa grypy w postaci plazmidu stymuluje powstanie wyspecjalizowanych populacji cytotoksycznych limfocytów.

Niewątpliwą zaletą szczepionek uzyskiwanych z zastosowaniem technik rekombinacji DNA jest ich stabilność, bezpieczeństwo procesu produkcji oraz to, że w trakcie ich stosowania nie zanotowano efektów ubocznych. Ponadto preparaty te można relatywnie szybko modyfikować oraz wprowadzać zmiany odzwierciedlające mutacje zachodzące w komórkach patogenów.

Choroby genetyczne, których przyczyną są defekty w pojedynczych genach oraz choroby wielogenowe.

Taktyka zdecydowanej większości szczepionek przeciw nowotworom polega na jednoczesnym wprowadzaniu antygenów znajdujących się na danym typie komórek nowotworowych i właściwych sygnałów kostymulujących. Takie postępowanie ma spowodować swoistą mobilizację komórek układu immunologicznego przeciw komórkom nowotworu, które mogłyby inicjować powstawanie nowych ognisk chorobowych. Istnieje również nowsza koncepcja szczepionek przeciwnowotworowych, modyfikowanych genetycznie. Polega ona na pozyskaniu tkanki z guza, wyizolowaniu z niej komórek nowotworowych, następnie na wprowadzeniu genu kodującego takie czynniki immunomodulacyjne jak antygeny nowotworowe lub cytokiny, namnożeniu w hodowlach in vitro i wreszcie wstrzyknięciu tak przygotowanego preparatu pod skórę lub wprost do guza osoby chorej. Nośnikiem genów są w tym przypadku rekombinowane retrowirusy oraz adenowirusy. Próby z zastosowaniem tych szczepionek przeprowadza się w profilaktyce takich nowotworów jak czerniak złośliwy, białaczki, nowotwory nerek, płuc oraz piersi.

  1. DIAGNOSTYKA.

Infekcje:

  • sondy genetyczne pozwalają na szybkie zdiagnozowanie patogennego organizmu, eliminują potrzebę namnażania drobnoustrojów,
  • technika PCR umożliwia rozpoznanie już przy minimalnej ilości materiału genetycznego wyizolowanego z komórek drobnoustrojów,

Choroby genetyczne:

Obecnie, stosując techniki analizy cząsteczek kwasów nukleinowych można zdiagnozować ponad sto chorób, a wśród nich między innymi: anemia sierpowata, achondroplazja, talasemia, hemofilia, mukowiscydoza fenyloketonuria i wiele innych.

Prenatalna diagnostyka z zastosowaniem wspomnianej już techniki opartej na polimorfizmie długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP).

Diagnostyka chorób nowotworowych.

  1. TERAPIA.

Przykładami leków nowej generacji mogą być:

  • insulina - pierwszy z leków, który powstał dzięki zastosowania technikami inżynierii genetycznej. Jako pierwszemu przyznano mu licencję. Hormon, który wcześniej stosowano w terapii cukrzycy, pozyskiwany był z komórek trzustkowych świni oraz krów. Cząsteczki te nie była takie same jak ludzkie. Z tego właśnie powodu część osób chorych produkowała przeciwciała skierowane przeciw omawianemu białku. Insulina powstająca przy zastosowaniu inżynierii genetycznej jest dokładnie taka sama, jak ta którą produkują ludzkie komórki trzustkowe. Gen dla tego białka jest eksprymowany do plazmidów znajdujących się w komórkach Escherichia coli. We wczesnych etapach pracy nad uzyskaniem cząsteczki insuliny, łańcuchy A oraz B syntetyzowano oddzielnie, a kolejny etap polegał na fałdowaniu ich tak aby uzyskać dojrzałą cząsteczkę białka. Obecnie dla celów komercyjnych, eksprymuje się całe białko, a następnie jest ono cięte w taki sposób aby od razu otrzymać dojrzałą cząsteczkę insuliny.
  • ekspresję ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) można uzyskać w komórkach bakteryjnych dwiema metodami. Pierwsza z nich polega na zaprojektowaniu odpowiedniego wektora ekspresyjnego, w oparciu o cząsteczki cDNA, w których znajdują się prawie wszystkie aminokwasy wchodzące w skład cząsteczki hormonu oraz dołączeniu do niego syntetycznego oligonukleotydu początkowego. W tym przypadku hormon eksprymuje się wewnątrzkomórkowo. Druga metoda różni się od pierwszej tym, że na początku genu dodano specjalną sekwencję sygnałową, która pozwalała na przetransportowanie zsyntetyzowanego białka do przestrzeni peryplazmatycznej. Stąd hormon może zostać z łatwością uwolniony na zewnątrz komórki.
  • tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) na skalę komercyjną produkuje się go hodowlach komórek izolowanych od ssaków. Fragmenty ludzkiego cDNA kodujące gen dla omawianego białka sklonowano pod silny promotor oraz terminator. Stransfekowane w sposób stabilny linie komórek izolowanych od ssaków są więc wektorem, niosącym gen dla tPA. Te z linii, które wykazują w hodowlach wysoki poziom ekspresji białka, namnaża się dużych fermentatorach, natomiast zrekombinowany tPA oczyszcza się później z pożywki.
  • VII czynnik krzepnięcia krwi konieczny do tego, aby procesy krzepnięcia zachodziły w prawidłowy sposób jest również produkowany w komórkach ssaków. Przez szereg lat osobom cierpiącym na hemofilię czynnik ten był podawany po uprzednim oczyszczeniu go z krwi ludzkiej. W pewnym stopniu zabieg ten przyczyniał się do szybszego szerzenia się pandemii AIDS. Dziś fragment cDNA z genem dla tego czynnika został sklonowany. Tak jak ludzki hormon wzrostu jest on kompleksem białkowym o znacznych rozmiarach i z tego właśnie powodu jego prawidłowe składanie i produkcja może zachodzić jedynie w komórkach izolowanych od ssaków.

Komórki somatyczne modyfikowane genetycznie czyli tzw. somatyczna terapia genowa.

Każdą próbę podjęcia terapii genowej musi poprzedzać kilka czynności - sklonowaniem wybranego genu, odszukanie właściwych mu sekwencji regulacyjnych oraz komórek, we wnętrzu których będzie mógł ulegać ekspresji i oczywiście znalezieniem wydajnych metod pozwalających na ich stransfekowanie. Należy również przeprowadzić eksperymenty, które niezaprzeczalnie dowiodą, iż prawidłowy gen po wprowadzeniu do komórki będzie działał tak jak przewidywano i nie spowoduje zaburzeń ani w metabolizmie komórki, do wnętrza której został wprowadzony, ani w całym organizmie. Istnieją dwie odmiany terapii:

  • można wprowadzać do komórki więcej niż jedną kopię prawidłowego genu,
  • można również wymienić wadliwy gen na jego prawidłową formę.

Istnieją również dwa sposoby wprowadzenia genów do komórek:

  • pobranie komórek docelowych z organizmu osoby, która ma być poddana terapii, wykonanie modyfikacji genetycznych in vitro, a następnie ponowne wprowadzenie komórek do organizmu,
  • wprowadzenie genów wprost do określonej tkanki bądź całego organizmu.

Stosowaniu terapii genetycznej towarzysza pewne trudności m.in.:

  • problemy ze znalezieniem takiego systemu wprowadzania genów do komórek eukariotycznych (transfekcji), który byłby wydajny,
  • ekspresja wprowadzanych do komórek genów jest bardzo często przejściowa.

Terapia genowa jest stopniowo wprowadzana w trakcie leczenia:

  • chorób, których przyczyną jest mutacja w pojedynczym genie,
  • chorób których przyczyną są mutacje w wielu genach np.: chorób układu krążenia, układu nerwowego, różnych odmian raka,
  • chorób o podłożu autoimmunologicznym.

Jako przykład można wskazać:

  • próby znakowania limfocytów oddzielonych od litego guza pacjenta. Polegało to na wprowadzono do komórek limfocytów genetycznego markera - był nim gen nadający oporność na neomycynę, a następnie śledzeniu ich migracji po ponownym wstrzyknięciu ich od organizmu. Po pewnym czasie po raz kolejny pobierano je i transfekowano w hodowlach in vitro genami warunkującymi ekspresję interleukiny 2 oraz czynnika martwicy nowotworów.
  • próby terapii SCID - jest to tzw. ciężki złożony niedobór immunologiczny. W tym przypadku wprowadzano do krwioobiegu komórki limfocytów, do których wprowadzono wektor retrowirusowy, niosący prawidłową formę genu. Skutkowało to wykształceniem odporności na antygeny oraz wytwarzaniem przeciwciał.
  • próby terapii hemofilii typu B - komórki hemocytoblastów transfekowano wektorem retrowirusowym, z wklonowanym genem kodującym czynnika IX.
  • próba terapii rodzinnej hipercholesterolemii - transfekcji hepatocytów wektorem adenowirusowym niosącym gen kontrolujący proces biosyntezy białka receptora dla LDL.
  • próby terapii niedoborów somatotropiny - transfekcja hepatocytów wektorem retrowirusowym.

Mino wielu obiecujących wyników terapia genowa dotychczas nie została wprowadzona do powszechnej praktyki klinicznej.

Niezwykle istotny wpływ na rozwój wielu z wyżej wymienionych zastosowań inżynierii genetycznej okazały się takie technologie jak:

  • wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych - metoda ta polega na izolowaniu komórek ze śledziony myszy, którą wcześniej poddano immunizacji odpowiednim antygenem i wymieszaniu ich z celowo zmutowanymi liniami komórkowymi nowotworu zwanego szpiczakiem (mutacja polega na wprowadzeniu zmiany uniemożliwiającej wzrost w określonym medium hodowlanym). Część z tych komórek ulegnie zespoleniu. Kolejnym krokiem jest przeprowadzenie w warunkach in vitro selekcji polegającej na umieszczeniu hodowli w medium, w którym mogą rosnąć tylko te klony hybrydowe, które powstały w wyniku fuzji wymienionych komórek. Dalszą hodowlę prowadzi się w studzienkach, zawierających klony jednej tylko komórki. Owe klony hybrydowe mają zdolność do wytwarzania przeciwciała o określonej swoistości i co najważniejsze przy prawidłowo prowadzonej hodowli jest praktycznie nieśmiertelny (cechę tą nadają klonom geny pochodzące z komórek nowotworowych). Przeciwciała monoklonalne znajdują obecnie szerokie zastosowanie w diagnostyce nowotworów oraz infekcji wywoływanych przez drobnoustroje.

W tak zwanej inżynierii białek stosuje się rekombinowane cząsteczki DNA aby naturalnie występującym w organizmie białkom nadać nowe, lepsze właściwości albo zmodyfikować ich funkcje. Odpowiednim przykładem mogą tutaj być przeciwciała, bo istnieje bardzo wiele możliwości ich zastosowania w medycynie, a ich budowa jest w dużej mierze poznana. Istnieją możliwości dokonania modyfikacji w obrębie tzw. domen efektorowych czyli tych regionów łańcucha ciężkiego, które odpowiadają za specyficzność danego przeciwciała. Duże nadzieje pokłada się w strategii polegającej na wprowadzeniu w miejsce sekwencji kodującej domenę efektorową przeciwciała, genu kodującego toksynę. Powstałe w wyniku tego zabiegu przeciwciało mogłoby wprowadzać toksyny do wybranych komórek, posiadających na swojej powierzchni rozpoznawany przez nie antygen. Metoda ta może okazać się nową alternatywą w terapii nowotworów albo chorób wirusowych, w tym AIDS.

Mnogość nowoczesnych technik skłania nas do przemyślenia w jaki sposób można dzięki nim udoskonalać życie współczesnych ludzi.