Sztuczna ingerencja w informację genetyczną organizmów żywych ma na względzie zarówno uzyskanie odpowiedzi na fundamentalne pytania frapujące uczonych od dawien dawna, jak też korzyści praktyczne. Łatwiejszym obiektem modyfikacji są rośliny. Większość roślin wieloletnich można rozmnażać wegetatywnie w warunkach ogrodowych po prostu ułamując gałązki lub przepoławiając bulwy. Wielkim osiągnięciem było wyhodowanie w 1958 roku przez Stewarta rośliny marchwi z pojedynczej komórki pochodzącej z korzenia. Rozwój hodowli roślin in vitro umożliwił otrzymywanie wielkiej ilości klonów w krótkiej przestrzeni czasu. Można zmodyfikować genetycznie komórkę, a następnie, nie czekając na to, aż wyda nasiona, uzyskać setki podobnych roślin wyhodowanych na specjalnej pożywce. Jednym z zagadnień fizjologii roślin jest mechanizm regulacji ekspresji genów z udziałem światła. Od dawna wiadomo, że każdy żywy organizm zawiera molekularny zegar biologiczny, najczęściej składający się z kilku specyficznych białek. Zegar jest połączony z kaskadą enzymatyczną, która prowadzi do ekspresji genów, a z drugiej strony nastawiany przez światło. To ono dostosowuje rytmy biologiczne do aktualnej długości doby. Jak wiemy, jedynie niewielki pas Kuli Ziemskiej wzdłuż równika cechują stosunkowo nieznaczne wahania długości okresu światła i ciemności. Zagadka będąca do rozwiązania przypomina trójkąt, którego jeden narożnik stanowią procesy ewidentnie regulowane przez światło, jak pora kwitnienia, sezonowe zmiany w rozwoju roślin (jesienią i wiosną), ruchy okołodobowe (nyktinastie) i heliotropizm. "Drugim narożnikiem" jest ekspresja genów, trzecim udział światła w mechanizmach regulacji biochemicznej. Mogąc dozorować procesy z "pierwszego narożnika", a także dokonując zmian w genach, mamy otwartą drogę do rozszyfrowania całego trójkąta.
Jeśli chodzi o praktyczne korzyści z manipulacji genami roślin, poszukuje się odmian roślin odpornych na mróz, suszę, ataki owadów czy herbicydy, o dłuższym okresie kwitnienia lub szybszym wzroście. Chcąc zadowolić z kolei konsumentów, wprowadzamy na rynek owoce i warzywa trudniej psujące się, o dłuższej trwałości, o atrakcyjniejszym smaku, zapachu i wyglądzie. Trzecią dziedziną badań jest stwarzanie roślin, które dostarczyć mogą określonych produktów, takich jak polistyren, guma, włókna o określonej barwie, przez zastąpienie produkcji fabrycznej oszczędzające krocie pieniędzy przemysłowców.
Dzisiaj do hodowli roślin in vitro potrzebna jest jedynie sterylna szklarnia i komplet pożywek, które podaje się we właściwym momencie i w określonej sekwencji. O wiele trudniejsza, bo wymagająca ogromnej precyzji i znajomości tak biologii molekularnej, jak fizjologii i embriologii jest modyfikacja genomu komórki roślinnej, z której wyhoduje się pierwszy klon. Wykorzystano tutaj bakterie atakujące korzenie niektórych roślin, z gatunku Agrobacterium tumefaciens. Plazmid, mały kolisty fragment bakteryjnego DNA, jest wszczepiany w genom komórki roślinnej, która wraz z resztą zainfekowanych tworzy rakowatą narośl. Wewnątrz bakterie odnajdują korzystne warunki do życia. Plazmid taki zostaje wykorzystany jako "koń trojański". Dzięki użyciu specjalnych narzędzi molekularnych (enzymów restrykcyjnych) możliwe jest wbudowanie do niego praktycznie każdego genu, który następnie integruje się z genomem komórki roślinnej. Postępowym agronomom pozostaje zidentyfikować cechę, która ma być zmieniona lub ulepszona. Warunkujący ją gen należy zidentyfikować i oznaczyć tak, by dało się go później odnaleźć. Robi się to, sprzęgając cegiełki DNA z barwnikiem lub wbudowując weń cząsteczki radioaktywne. Gen umieszczony w wektorze wstrzykuje się do komórki, następnie identyfikuje komórki, gdzie zaszła prawidłowo integracja z którymś z chromosomów. Z tych komórek regeneruje się in vitro całe rośliny. Potem pozostaje tylko sprawdzić, czy gen przechodzi na potomstwo i jest obecny w nasionach. Plazmid jest małą, kolistą cząsteczką DNA, którą bakterie umieją przekazywać sobie nawzajem. Dzieje się to nie tylko pomiędzy różnymi gatunkami bakterii, ale nawet pomiędzy bakteriami a na przykład grzybami. Plazmid zwykle zawiera geny zwiększające szansę przeżycia organizmu w konkretnym środowisku, na przykład geny na enzymy alternatywnych szlaków metabolicznych z wykorzystaniem dostępnych substratów, na enzymy beztlenowych szlaków oddechowych czy chroniące przed antybiotykami. Inżynierowie wykorzystują zjawisko istniejące w przyrodzie przypuszczalnie tak dawno, jak długo istnieje życie. Udaje się też wprowadzać "gołe" geny bez dodatkowych wektorów, po prostu poddając szokowi elektrycznemu komórki zawieszone w medium zawierającym DNA. Jest to metoda tak zwanej elektroporacji.
Inżynieria genetyczna zwierząt ma bardzo istotny aspekt, jakim jest zastosowanie w medycynie. Zrozumienie funkcji pełnionych przez cząsteczki białek w rozmaitych procesach fizjologicznych zbliża nas do celu, jakim jest "rozłożenie na czynniki pierwsze" chorób człowieka. Problem leży w trudności z otrzymaniem poszczególnych białek w stanie czystym. Cytoplazma normalnej komórki ludzkiej zawiera kilkaset białek i uczeni dużo by dali, żeby móc śledzić losy każdego z nich z osobna i wyłonić zjawiska, które prowadzą do choroby. Szczególnie interesujące dla biologów molekularnych są skutki różnicy struktury białek regulatorowych dla ekspresji genów. Jesteśmy świadkami rozkwitu redukcjonizmu w biologii, czyli poglądu, który każe widzieć życie jako złożony efekt podstawowych oddziaływań, jako "przejście ilości w jakość". Stężenie insuliny w granicach normy warunkuje fenotyp zdrowy. Stężenie niższe, niż progowe, to cukrzyca z całym wachlarzem jej przejawów i skutków.
Wchodząc na grunt chorób, musimy zmierzyć się z pojęciem "terapia genowa" wraz ze wszystkimi nadziejami i obawami, jakie niesie. Możliwe są dwa podejścia do "leczenia chorych genów"; możemy stosować terapię wtedy, gdy zaledwie spodziewamy się choroby, czyli u komórek młodego zarodka, albo u wybranych komórek somatycznych objętych chorobą. Zasadniczo terapia genowa polega na dostarczeniu komórce sprawnej kopii genu. Z organizmu chorego pobiera się komórki, a następnie hoduje na sztucznym podłożu. Hodowla taka wymaga dużych umiejętności i doświadczenia. Bardzo często z błahych powodów komórki obumierają, ulegają infekcjom lub nie podejmują podziałów. Dopiero gdy uzyska się stabilną linię komórkową, można dokonać jej transformacji genetycznej za pomocą wektora. Do wektora wbudowuje się obok genu łatwy do detekcji znacznik, aby komórki, w których gen uległ prawidłowemu wbudowaniu w DNA, można było odizolować i po namnożeniu wprowadzić z powrotem do organizmu. Jako wektorów zazwyczaj używa się retrowirusów, które potrafią przepisywać RNA na DNA, włączany następnie do genomu. Najciekawsze doświadczenia z terapią genową dotyczą "dzieci z bańki", najmłodszych cierpiących na poważny defekt immunologiczny, który nie pozwala im żyć poza sterylnym namiotem tlenowym. "Po tym, co przeszliśmy, patrzenie, jak bawi się z innymi dziećmi jest po prostu zdumiewające. Odkąd złamano kod genetyczny i znaleziono gen, potrafią czynić cuda" - zwierzyła się mama kilkuletniego Rhysa, którego jedynie pobyt w szpitalu chronił dotąd przed zagrażającymi życiu infekcjami. Do komórek jego szpiku wprowadzono gen, który rozpowszechnił się w limfocytach. Były i tragiczne przypadki: wbudowanie wirusa spowodowało kilkukrotnie białaczkę i śmierć dziecka.
Oczywiste jest, że, po zniwelowaniu możliwości skutków ubocznych takich, jak rozwój raka, umieszczanie genów już w komórkach bardzo wczesnego zarodka, czy nawet w gametach byłoby efektywniejszym rozwiązaniem. Choćby dlatego, że żadna komórka nie jest wieczna i z czasem pula wszczepionych somatycznych komórek z transgenem zmaleje. Operacja taka udała się już u roślin, muszek owocowej, a nawet u ssaków. U muszek owocowych zastosowano tak zwany transpozon P. W transpozon wbudowuje się badany gen, a następnie wstrzykuje do bardzo wczesnych zarodków. Rozpowszechnia się na większość komórek młodej muszki, w tym na komórki macierzyste linii płciowej. Potomstwo transgenicznego samczyka i samiczki będzie miało wszystkie komórki homozygotyczne pod względem transgenu. Metoda, którą opisano, otworzyła także możliwości identyfikacji genów i regulacji ich ekspresji. Wiele genów sąsiaduje z sekwencjami regulatorowymi, więc jeżeli ekspresja genu w komórce, do której go przeszczepiono, znacznie różni się od ekspresji normalnej, może to oznaczać, że gen związany był z sekwencją regulatorową, którą trzeba odnaleźć. Może to też oznaczać obecność w komórce biorcy czynnych inhibitorów genu.
Transgen ulega przypadkowemu wbudowaniu w dowolne miejsce dowolnego chromosomu. Niekiedy dochodzi do przerwania ważnych genów przez transgen. Zwykle transfekuje się większą ilość komórek, z których część okazuje się zdolna do życia. Niekiedy jednak transgen "trafia" w inny gen, nie powodując obumarcia organizmu, ale wyraźny efekt fenotypowy. Takie komórki namnaża się, a ponieważ transgen jest wyznakowany, da się dokładnie określić, w jakie locus się wbudował. Tym samym znamy już lokalizację genu związanego z obserwowanym efektem fenotypowym. Pamiętajmy jednak, że relacje DNA - cecha fenotypowa są znacznie bardziej złożone, dlatego możemy mówić jedynie, że odnaleźliśmy "gen związany z warunkowaniem cechy A", nie wykluczając roli w tym innych, nieznanych jeszcze genów. Szczególnie pasjonujące są odkrycia związane z genami sterującymi rozwojem organizmu, mówiące o tym, jak wygląda droga od pojedynczej komórki do kompletnego, sprawnego organizmu.
W klonowani ssaków stosuje się nieco odmienne metody, niż w przypadku innych organizmów. Do jądra zapłodnionego oocytu (zygoty) wstrzykuje się wektor z transgenem. Zygotę można inkubować przez pewien czas, odpowiadający mniej więcej wędrówce jaja z do macicy. Blastocystę inkubuje się w macicy matki zastępczej (zwykle po kilka). DNA transgeniczny obecny więc będzie we wszystkich komórkach młodego organizmu (wiadomo, że część zygot obumrze, gdyż transgen wbuduje się w ważne regiony regulatorowe i konstytutywne). Transgeniczne potomstwo można, jak wspomniałem, zróżnicować pod kątem różnych zaburzeń fenotypu, a następnie pobierać od nich komórki i oznaczać miejsce, gdzie transgen wbudował się.
Jednym z ciekawszych zastosowań transgenów jest tropienie mechanizmów powstawania nowotworów i zapobiegania im. Onkogenami nazywamy sekwencje DNA, których ekspresja lub nadekspresja sprawia, że komórka nabywa cech komórki nowotworowej. Należą do nich przede wszystkim geny odpowiedzialne za szlak przekazu informacji od receptorów błonowych do jądra komórki, ponieważ istotą nowotworu jest utrata kontroli nad komórką (głównie jej podziałami). Geny te posiada każda zdrowa komórka . Noszą nazwę protoonkogenów. Jeżeli dojdzie do infekcji retrowirusowej, RNA wirusa jest przepisywany odwrotnie na DNA, po czym integruje się z genomem komórki. Kiedy wirus ma infekować dalsze komórki, DNA jest przepisywany na RNA, przy czym może dojść do "omyłkowego" przepisania również sąsiednich sekwencji genowych gospodarza. Są one ponownie przepisywane przez retrowirus na dalsze komórki. Tak dochodzi do zwielokrotnienia genu. Jeżeli stało się tak z sekwencją protoonkogenu, dochodzi do jego niekontrolowanej i wzmożonej ekspresji, a od tego momentu mówimy o aktywnym onkogenie. Aby zidentyfikować onkogen, należy DNA pobranym z guza transfekować hodowlane komórki 3T3 myszy. Mają one zdolność przylegania do siebie i do dna naczynia, w którym rosną. Gdy pokryją cała powierzchnię ścianek, podziały komórek ustają w wyniku tzw. inhibicji kontaktowej. Jeżeli w DNA obecny jest onkogen, dochodzi do lokalnych zaburzeń inhibicji kontaktowej i w płaskiej kulturze in vitro powstają guzki. Z tych guzków można wyizolować DNA i metodami biologii molekularnej oznaczyć ludzki onkogen. Onkogeny mogą należeć do szlaku apoptozy, indukowanej śmierci komórki. Istnieją mechanizmy, które na taką śmierć pozwalają wówczas, gdy komórka staje się niebezpieczna dla otoczenia np na skutek zainfekowania wirusem, uszkodzenie DNA lub gdy jest ich nadmiar. Przykładowo po zwalczeniu infekcji u większości limfocytów zachodzi apoptoza, a pozostałe przy życiu zwane są komórkami pamięci immunologicznej. Ciekawe badania nad onkogenami przeprowadzono z wykorzystaniem sekwencji regulatorowej genu insuliny u myszy. Jego ekspresją steruje sekwencja umieszczona w sąsiedztwie genu. Dochodzi do niej w wysepkach β Langerhansa trzustki (i nigdzie więcej), gdyż tylko tam występuje sprzyjające jej środowisko. Sekwencję regulatorową owego genu sprzężono metodami inżynierii genetycznej z genem, który kodował duży antygen białkowy T małpiego wirusa SV40. Antygen T działa w komórkach ssaków jako onkogen, to znaczy aktywuje geny wywołujące złośliwe nowotwory. U poddanych eksperymentowi myszy doszło do zmian nowotworowych wybiórczo w wysepkach β Langerhansa trzustki (wyspiaków, gruczolaków wyspowokomórkowych). W ten sposób potwierdzono znaczenie czynników transkrypcyjnych i odpowiadających im sekwencji regulatorowych genów na ekspresję genów. Ekspresja zachodzi w różnych populacjach komórek w sposób selektywny, choć komórki zawierają wszystkie geny organizmu. Transgeniczne myszy chore na nowotwór można wykorzystywać przy pracach nad skutecznym jego zahamowaniem.
W organizmie nie ma komórki, która wykorzystywałaby naprawdę znaczny procent wszystkich genów w ciągu życia. Genom jest wielką biblioteką, a każda komórka bierze z niego tylko swoją własną informację. Co więcej, komórka kości nigdy nie stanie się komórką mięśniową. Do bardzo ciekawych należą badania nad takimi komórkami, których możliwości rozwoju są jeszcze bardzo duże. Taki multipotencjalny charakter mają komórki wczesnych zarodków, komórki krwi pępowinowej oraz tak zwane komórki progenitorowe. Każda tkanka oprócz dojrzałych, wykształconych w pełni komórek posiada pulę komórek macierzystych, które przeznaczone są do wypełniania luk po obumarłych składnikach tkanki. Mają one cechy komórek embrionalnych i uczonym udaje się przeszczepiać je pomiędzy zupełnie różnymi tkankami, gdzie rozwijają fenotyp właściwy dla tkanki docelowej, a nie macierzystej. Takie komórki są nadzieją na leczenie chorób degeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona, Huntingtona, Alzheimera, stwardnienie rozsiane, rekompensacji skutków udaru mózgu czy zawału serca. Tego typu terapia byłaby alternatywą dla stosowania komórek pobranych z ludzkich embrionów. Powstające banki krwi pępowinowej to rezerwuary zamrożonych komórek macierzystych, które mogą przydać się po kilkudziesięciu latach po prostu jako mikroskopijne "części zamienne". Inżynieria genetyczna znalazła szerokie zastosowanie w farmakologii, ponieważ bakterie lub drożdże (ale też rośliny i ssaki) mogą być transfekowane genem, którego produkt pojawia się w medium hodowlanym, częściach zielonych lub w mleku. Tym sposobem uzyskuje się tanie i wysoce oczyszczone hormony, czynniki krzepnięcia krwi, interferon i interleukiny. Interferony to naturalnie występujące w organizmie białka zapobiegające szerzeniu się infekcji wirusowej i rozrostowi nowotworów. Ich aktywność jest specyficzna gatunkowo, tak że jedynym źródłem interferonu dla człowieka mógł być organizm innego człowieka. Podobnie hormon wzrostu ekstrahowany był z przysadek mózgowych ludzi zmarłych w wypadkach itp. Odkąd te i inne farmaceutyki wytwarzane są przez mikroorganizmy, dysponujemy nimi w dużych ilościach, koszty produkcji sprowadzają się do wymiany medium i oczyszczania substancji, a po oczyszczeniu produkt jest identyczny z ludzkim. W niedalekiej przyszłości chory czekający na serce po prostu pozwoli na pobranie swojej krwi, z niej inżynier wyizoluje DNA i ludzkimi antygenami zgodności tkankowej (gen na białka MHC) transfekuje embriony świni - nokauta pod względem własnych MHC. Tym sposobem po kilku latach otrzyma serce z jego własnym "sygnałem identyfikacji". Nie będzie potrzeby stosowania uciążliwej terapii immunosupresyjnej, ponieważ zniknie ryzyko odrzucenia takiego przeszczepu.
