Metody modyfikacji genetycznej zwierząt i jej wykorzystanie

Inżynieria genetyczna wykorzystywana jest w wielu dziedzinach nauki, a efekty jakie wywołuje są badanie pod różnym kątem, z różnych punktów widzenia. Uzyskanie jak największej ilości białek o jak najlepszej jakości interesuje głównie chemików, po przeprowadzeniu modyfikacji genomu. Natomiast biologia zainteresowana jest wpływem tych zmian na pierwotny genom, na reakcję komórki i wreszcie na reakcję całego organizmu, u którego zmiana została wprowadzona. Wprowadzając takie zamiany można uzyskać informacje o procesach zachodzących w zdrowych organizmach oraz o zaburzeniach ich działania w wyniku jakiejś choroby. Jednym z najbardziej istotnych i rewolucyjnych osiągnięć inżynierii genetycznej była i jest możliwość wprowadzania ściśle określonych genów do genomu pojedynczych komórek bakteryjnych, wirusowych, roślinnych i zwierzęcych. Biologia doszła do sedna zmienności organizmów, a naukowcy zdolni są wnioskować o stanie fizjologicznym i morfologicznym organizmu na podstawie drobnych zmian w genomie, czy pojedynczej komórce. Poza tym możliwości współczesnej biologii wychodzą znacznie poza samo opisywanie funkcji i cech organizmów, obecnie jesteśmy w stanie te organizmy zmieniać, tak, jak nie zrobiłaby tego natura.

Jedną z pierwszych i najbardziej rozpowszechnionych metod modyfikacji genetycznej komórek zarówno eukariotycznych, jak i prokariotycznych jest wprowadzanie nowego odcinka DNA (np. cDNA) poprzez przyłączenie go do wektora, którym może być fagi, wirusy, plazmidy, transpozony itd. Zmiany dokonywane na organizmach jednokomórkowych są widoczne bardzo dobrze, bo dotyczą jednocześnie całego organizmu. Można je także nazwać mianem terapii genowej, kiedy zastępowany jest gen uszkodzony, genem prawidłowym. Jednak stosowanie terapii genowej u organizmów wyższych jest nieco bardziej skomplikowane i wymaga wzięcia pod uwagę znacznie większej liczby czynników, choćby w związku z rozmnażaniem płciowym, a co za tym idzie wytwarzaniem dwóch typów komórek. Można zatem modyfikować tylko komórki somatyczne. Cały proces rozpoczyna się od pobrania komórek z organizmy, następnie umieszcza się je na pożywce, by mogły się swobodnie dzielić i rozwijać. Kolejnym etapem jest wprowadzenie do komórek wektora, do którego wprowadzono konkretny, obcy gen. Tak przygotowane komórki wprowadza się następnie do organizmu, z którego zostały pobrane. Technika ta może być także wykorzystana w terapii genowej stosowanej w przypadku chorób o podłożu genetycznym u ludzi. Obecnie w badaniach stosowane są komórki pobierane ze szpiku kostnego ludzi; wśród tych komórek znajdują się także komórki prekursorowi elementów morfotycznych krwi (krwinek). Komórki można transformować na wiele sposobów. Jednym z najpopularniejszych w takim przypadku jest wykorzystanie materiału genetycznego retrowirusów, do których wprowadza się konkretny gen. Badania takie przeprowadzano z sukcesami na dzieciach z zespołem SCID (ciężkim, złożonym niedoborem immunologicznym). Jest to choroba spowodowana brakiem enzymu dezaminazy adenozynowej, która odpowiedzialna jest za prawidłowe funkcjonowanie limfocytów. Przyczyną tego stanu jest defekt genetyczny, uszkodzony jest gen kodujący ten enzym. W trakcie terapii wprowadzano prawidłowy allel genu kodującego dezaminazę bezpośrednio do limfocytów osób chorych. W związku z obiecującymi wynikami tego leczenia, rozważa się leczenie w ten sposób innych chorób, wprowadzając prawidłowy gen do krwinek.

Wszystkie wymienione wyżej eksperymenty wykonywane są na komórkach somatycznych, w związku z czym zmiany, które zachodzą pod wpływem modyfikacji genomu są tylko doraźne (do końca życia zmodyfikowanego osobnika) i nie są dziedziczone. Dzieje się tak, dlatego, że komórki linii płciowej powstają bardzo wcześnie w rozwoju zarodkowym. Dlatego, aby uczynić daną transformację dziedziczną należy jej dokonać właśnie w tych komórkach. Zmian tych dokonuje się na niewielką skalę i jak dotąd na niewielu organizmach. Zmodyfikowano w ten sposób muszkę owocową, myszy, szczury i inne drobne zwierzęta laboratoryjne, a także rośliny. W eksperymencie na muszce owocowej do modyfikacji wykorzystano jako wektora transpozonu, nazwanego elementem P. Transpozon jest elementem ruchomym DNA, który przemieszcza się w obrębie genomu i może powodować mutacje. W transpozon wbudowany został pożądany gen, a następnie sam transpozon został wprowadzony do zarodka muszki, który znajdował się na bardzo wczesnym etapie rozwoju. Po wprowadzeniu transpozonu został on wbudowany w genom zarodka, włącznie z wprowadzonym genem. W rezultacie otrzymuje się potomstwo, które posiada sztucznie wprowadzony gen, tak jak przyszłe pokolenie. Tak zmodyfikowane organizmy, które zdolne są do wydawania potomstwa, które także zawiera wprowadzony gen, nazywane są organizmami transgenicznymi. Sztucznie wprowadzony, dodatkowy gen w genomie zmodyfikowanego organizmu nazywany jest transgenem. Takie wprowadzanie genów stwarza wielkie możliwości dla naukowców, umożliwiając im badanie różnych procesów życiowych, ich zaburzeń, a także zależności w położeniu wprowadzonego genu od sąsiadujących z nim sekwencji DNA. Zwłaszcza te ostatnie zależności są istotne, biorąc pod uwagę fakt, że transgen włącza się w genom w nieprzewidywalnym miejscu i niekoniecznie jest to miejsce, które zajmuje jego odpowiednik. Ponadto za każdym razem wprowadzony transgen będzie zajmował w genomie inne miejsce. Jest to doskonałym przykładem do obserwowania jak wpływają sekwencje DNA, które otaczają transgen na jego ekspresję. Zatem z transgenem muszą być połączone geny regulatorowe, które pozwalają na jego ekspresję. Pytanie tylko, które to sekwencje? Wiadomo także, że na ekspresję transgenu ma także wpływ położenie w genomie, rodzaj komórki, do której został wprowadzony, także jej stan i faza rozwoju.

Podobnie jak z muszką owocową postępowano z ssakami doświadczalnymi, do których komórek rozrodczych wprowadzano transgeny. Jak dotąd myszy transgeniczne są bardzo rozpowszechnione we wszystkich laboratoriach badawczych na świecie. Myszy można zmodyfikować niemal pod każdym kątem, w związku z czym, są doskonałym modelem do badań, imitującym organizm ludzki. Ale nie tylko myszy wykorzystuje się do takich badań; eksperymenty prowadzi się także na innych ssakach doświadczalnych (chomik, szczur, królik, kot), czy organizmach tj. ryby, świnie. Badania takie prowadzi się, by uzyskać jak najlepsze efekty w produkcji białek na dużą skalę, które wykorzystywane byłyby w medycynie.

Jest kilka metod otrzymywania myszy transgenicznych, ale najczęściej wykorzystywana i najbardziej efektywna jest metoda polegająca na wstrzyknięciu transgenu do zapłodnionego jaja myszy, a ściślej do jego jądra komórkowego. Następnie taki zarodek wprowadza się do macicy myszy, a w tym czasie obcy gen zostaje wbudowany w genom. Ma to miejsce wystarczająco wcześnie, by transgen był także obecny w komórkach linii płciowej, a zatem będzie on dziedziczny. Wszystkie organizmy otrzymane taką drogą poddaje się szczegółowym badaniom, by dokładnie oznaczyć czas oraz miejsce ekspresji genu, a także zmian wywołanych przez transgen w samym geninie. Bardzo ważny jest także wpływ kodowanego przez transgen białka, (które zaczyna być syntezowane przez komórkę) na cały organizm. Często w takich przypadkach transgen łączony jest z inną niż oryginalnie występującą sekwencją regulatorową, która spowoduje jego ekspresję. Tworzy się w ten sposób swego rodzaju mieszane geny, które w naturalnych warunkach nie istnieją.

Badania przeprowadzane na transgenicznych myszach przyczyniły się do wielu ważnych odkryć i potwierdzenia przypuszczeń w kwestiach dziedziczenia oraz chorób spowodowanych wadami genetycznymi. Jeden z eksperymentów przeprowadzany był z wykorzystaniem genu kodującego syntezę insuliny. Ekspresja tego genu zachodzi tylko w niektórych komórkach trzustki, a w pozostałych komórkach jest ona zablokowana przez odpowiednią sekwencję DNA. Eksperyment polegał na wprowadzeniu do wczesnego zarodka myszy odpowiednio stworzonej sekwencji DNA, która zawierała onkogenu wirusa SV40 o nazwie duży antygen T, oraz geny regulatorowe genu kodującego insulinę. Ta sekwencja regulatorowa zapewniała ekspresję dużego antygenu T tylko w komórkach trzustki, które normalnie produkowałyby insulinę. W rezultacie w komórkach, w których nastąpiła ekspresja onkogenu powstały nowotwory, które nazwane zostały wyspiakami. Co ważne ograniczone były one tylko do komórek produkujących insulinę. Wniosek z tego, że sekwencja regulatorowa kieruje ekspresją genu i jest ona ściśle określona i ograniczona do jednego typu komórek.

Podobna sytuacja ma miejsce, kiedy sekwencję regulatorową genu insulinowego zastąpi się sekwencją regulatorową genu kodującego elastazę. Jest to hormon tkankowy, który jest produkowany także przez trzustkę, ale przez komórki innego typu. W wyniku takiego połączenia nowotwory powstają tylko w komórkach syntezujących elastazę. I mimo, że wykorzystany onkogenu był taki sam jak w poprzednim przypadku, to jego ekspresja uwarunkowana była obecnością sekwencji regulatorowej genu elastazy.

Informacje uzyskane w takich eksperymentach pozwalają na ustalenie mechanizmu powstawania nowotworów, co pozwala na opracowywanie coraz nowszych i skuteczniejszych leków walce z nimi. Myszy wykorzystuje się także do testowania i sprawdzania efektywności otrzymanych leków, które w swoim założeniu mają hamować rozwój nowotworu.

Transformacja genetyczna organizmów roślinnych

Modyfikowanie gnomów roślinnych ma takie same główne założenia i cele jak modyfikowanie organizmów zwierzęcych. Jest to poznanie mechanizmów rządzących rozwojem i funkcjonowaniem roślin. Szczególne znaczenie mają jednak specyficzne tylko dla roślin zależności pomiędzy ekspresją poszczególnych genów a dopływem światła, czy różnicowanie się poszczególnych tkanek. Podobnie jak u zwierząt, aby wprowadzić transgen do genomu komórki roślinnej niezbędne jest użycie w tym celu wektora. U roślin wystarczy jedna komórka, by można było otrzymać całą roślinę. Jako przenośniki genu stosuje się u roślin najczęściej plazmidy bakteryjne. W przyrodzie są one obecne w genomie bakterii Agrobacterium tumefaciens, która powoduje bulwkowate zwyrodnienia na korzeniach roślin. Komórki bakterii zwykle wnikają do zranionej części rośliny, gdzie ich DNA, łącznie z plazmidem wnika do genomu rośliny. Zmiany, jakie wywołuje plazmid w DNA rośliny (ekspresja genów plazmidowych) objawiają się w postaci zgrubień i narośli na korzeniach. Co ważne z tak zmienionych komórek można wyhodować całkowicie zdrową roślinę. Jako jedyny znany naukowcom przykład zastosowania plazmidów do przenoszenia materiału genetycznego w przyrodzie, postanowili wykorzystać go do własnych celów nieco modyfikując mechanizm. W DNA plazmidowym umieszcza się dowolne geny lub gen sklonowany w warunkach in vitro, a następnie wprowadza się je wraz z komórkami bakteryjnymi do organizmu roślinnego. W tym czasie plazmid wraz z transgenem zostaje wbudowany w genom rośliny, gdzie wprowadzone geny ulegają ekspresji.

W ten sposób można otrzymać ze zmodyfikowanych roślin nasiona, które posiadają wbudowane obcy gen i przenoszą go. Obecnie już wiele roślin zostało w taki sposób zmodyfikowanych, co jest szczególnie obiecujące w przypadku roślin uprawnych o znaczeniu ekonomicznym (np. ryż, kukurydza, pszenica). Wprowadza się do ich gnomów geny, które odpowiadają za odporność na różne choroby, pasożyty, warunki klimatyczne (np. suszę), a także geny poprawiające plonowanie, smak, czy wartości odżywcze; do kwiatów geny, które nie pozwalają im tak szybko więdnąć, czy poprawiające zapach. Badania są prowadzone na szeroką skalę, ale rośliny takie nie są jeszcze tak bardzo rozpowszechnione w Europie jak w USA, z racji wielu sprzeciwów.

Mutacje

Oprócz wykorzystywania obcych genów, wprowadzanych do organizmów roślinnych i zwierzęcych, by zaobserwować ich ekspresję i skutki, jakie wywołują w organizmie, transgeny stosuje się także w innym celu. Są one wprowadzane do komórek także w miejscach, gdzie znajdują się geny kluczowe dla rozwoju i funkcjonowania organizmu. Nie jest to jednak takie proste, więc takie wykorzystanie transgenów jest oparte w dużej mierze na przypadku. Wiąże się to z tym, że transgen wprowadzany do genomu może być włączony w którekolwiek miejsce w jego obrębie. Ale ma to także swoje dobre strony, ponieważ umożliwia naukowcom badanie wpływu różnych sekwencji DNA, które znajdują się w pobliżu transgenu na jego ekspresję. Można także zbadać funkcję odcinka DNA, w którym został wprowadzony transgen (czy znajdują się tam geny kodujące jakieś cechy i jakie). Bardzo dużo informacji można uzyskać zwłaszcza, kiedy transgen zostanie wbudowany w takie miejsce, gdzie znajdują się ważne dla organizmu geny kodujące lub sekwencje regulatorowe takich kluczowych genów. Kiedy transgen zostanie tak umieszczony wpływa na ekspresję owego genu, powodując jego mutację. Skutkiem jest zazwyczaj upośledzona produkcja jakiegoś ważnego dla organizmu białka (np. enzymu), brak produkcji lub synteza takiego białka, które jest uszkodzone i nie może spełniać swoich funkcji. Taka mutacja w genie jest powodowana przez transgen i nie ma znaczenia, czy ulega one ekspresji.

Takie umieszczenie transgenu, w genie oryginalny nazywa się insercją i jest to metoda znana od dawna i stosowana z powodzeniem w badaniach nad dziedziczeniem i genomami bakterii, grzybów, czy kukurydzy. Mutacji, które będą dziedziczone można dokonać poprzez zakażenie retrowirusem zarodków (np. myszy) we wczesnym etapie rozwoju. Wbudowanie genów retrowirusa w okolicy ważnego funkcjonalnie genu prowadzi do zaburzenia jego funkcji. Może to doprowadzić do nasilonej ekspresji tego genu, zupełnym zahamowaniu jego ekspresji lub tylko jej ograniczeniu. Przykładem wzmocnienia ekspresji może być wprowadzenie obcego genu w bezpośrednie sąsiedztwo onkogenu, co w rezultacie prowadzi do powstania nowotworów.

Organizmy z pierwszego, zmodyfikowanego pokolenia np. myszy będą miały w transgen tylko w jednym z dwóch chromosomów homologicznych. W takim wypadku cecha kodowana przez transgen nie zawsze jest dobrze widoczna lub jest zupełnie maskowana przez inne geny. W celu otrzymania homozygot, które posiadają już w gamecie oba allele transgenu, prowadzi się chów wsobny. W takim wypadku nowe cechy są lepiej widoczne. Wówczas można taki gen zidentyfikować w genomie i sklonować go. Identyfikacja nie jest specjalnie trudna, wystarczy do tego użyć sondy molekularnej, którą jest np. fragment nici DNA komplementarny z fragmentem, na którym znajduje się transgen. Klonując takie geny wprowadza się je później do wielkiej biblioteki genowej, co pomaga później w identyfikacji poszczególnych sekwencji w badanym materiale, którym może być ludzkie DNA. Możliwość takiej wczesnej identyfikacji jest niezmiernie ważna, zwłaszcza we wczesnych etapach rozwoju. Zazwyczaj mutacje takie w genach mających duże znaczenie w rozwoju w przypadku człowieka są zazwyczaj śmiertelne we wczesnych etapach ciąży, w wyniku czego, płód zostaje wydalony. Duży postęp w badaniach na myszach umożliwia nam poznanie właśnie tych najwcześniejszych etapów rozwoju człowieka, a być może wkrótce dzięki ingerencji w genom (terapii genowej) będzie można nawet takie wady genetyczne usunąć.