Jednym z prostszych sposobów wykorzystania inżynierii białek jest udoskonalanie przy zastosowaniu oferowanych przez nią metod enzymów używanych podczas produkcji detergentów takich jak np. subtylizyna. Jaj nowszą wersją jest tak zwana cząsteczka drugiej generacji, nie podlegająca procesom inaktywacji przez dodawane do środków piorących wybielacze. Obecnie trwają również prace nad uzyskaniem cząsteczki charakteryzującej się obniżoną wrażliwością na wysoką temperaturę (tzw. cząsteczka III generacji).

Oprócz tego nowoczesne technologie inżynierii genetycznej są stosowane w:

  • procesach produkcji opakowań,
  • reakcjach syntezy biopolimerów.

Białko pochodzące z komórek roślinnych, znane pod nazwą thaumatyna może mieć bardzo duże znaczenie w przemyśle spożywczym. Jest ono około 1000 razy słodsze od powszechnie stosowanej sacharozy i z powodzeniem można je stosować zamiast obecnie znanych słodzików. Gen warunkujący ekspresję thaumatyny wprowadzono do komórek drożdży. Poprzedza go silny promotor. Okazało się, że omawiane białko ulega ekspresji z bardzo dużą wydajnością. W naturalnych warunkach nie jest to łatwe do osiągnięcia.

Renina jest enzymem wykorzystywanym w bardzo dużych ilościach w produkcji serów. Stosując metody inżynierii genetycznej dołączono do genu kodującego enzym, taki fragment nukleotydów, który jest odczytywany przez białka błonowe jako sygnał do eksportu pozakomórkowego. Dzięki temu zabiegowi jest on wydzielany w bardzo dużych ilościach do medium hodowlanego.

Stosując techniki inżynierii genetycznej ulepszono pewne właściwość roślin, które są korzystne z przemysłowego punktu widzenia. Powstały odmiany wykazujące zwiększoną produkcję skrobi albo takie odmiany, które produkują skrobię innym niż w naturalnej stosunku amylazy do amylopektyny, dzięki czemu jest ona przezroczysta. Dokonano też prób zmiany zawartości nienasyconych kwasów tłuszczowych.

ORGANIZMY TRANSGENICZNE, CZY MAMY SIĘ CZEGO BAĆ.

Organizmy transgeniczne to takie, którym do ich własnego materiału genetycznego wintegrowano nowy, dodatkowy, pochodzący od innego organizmu gen (tzw. gen heterologiczny), a procesu tego dokonano tak, aby ów gen znajdował się komórkach somatycznych i generatywnych. Obecność genu w komórkach generatywnych jest warunkiem jego dziedziczenia. Tego typu modyfikacja genetyczna ma charakter stały.

Metody uzyskiwania organizmów modyfikowanych genetycznie są odmienne w przypadku roślin i zwierząt.

ROŚLINY TRANSGENICZNE.

Zadziwiająca plastyczność rozwojowa oraz genetyczna tych organizmów jest podyktowana faktem, że w ciągu całej ontogenezy roślin, komórki merystematyczne, znajdujące się w ich ciele komórki zachowują aktywność, a część z nich łatwo może przejść w proces prowadzący do odróżnicowania. Mają więc charakter totipotencjalny. Komórki roślinne można również stosunkowo łatwo transformować. Łatwość z jaką można wprowadzić do nich obce geny nie gwarantuje stabilności ich ekspresji. Bardzo często mamy do czynienia z sytuacją, kiedy efekt, mający wystąpić po wprowadzeniu transgenu zanika po kilku pokoleniach. Rośliny posiadają bowiem aktywne mechanizmy pozwalające im eliminować efekty prowadzące do zakłócenia równowagi. Ponadto dużym utrudnieniem w przypadku przedstawicieli flory są słabo rozwinięte mechanizmy odpowiadające za rekombinację homologiczną, co w zasadzie wyklucza możliwości wintegrowania transgenu w ściśle określone miejsce w ich genomie.

Metody uzyskiwania roślin transgenicznych:

  • Naturalny sposobem transfekowania roślin dwuliściennych jest wprowadzanie cząsteczek DNA w wektorach plazmidowych pochodzących z komórek Agrobacterium. Tak zwane plazmidy Ti, izolowane z komórek Agrobacterium tumefaciens posiadają geny warunkujące syntezę opin - pochodnych aminokwasów, wykorzystywanych przez te bakterie jako źródło węgla. Oprócz tego w obrębie omawianego plazmidu znajdują się geny kontrolujące katabolizm opin, umożliwiające transfer plazmidu oraz jego replikację. Najistotniejszym z punktu widzenia inżynierii genetycznej fragmentem tego plazmidu jest docinek określany jako tzw. T-DNA. Ma on długości ok. 23 kilo par zasad i po infekcji integruje się do genomu rośliny. Właśnie w miejsce tego odcinka wprowadza się transgeny. Na każdym z końców fragmentu T-DNA znajdują się powtórzenia liczące 24 do 25 par zasad, konieczne aby możliwa była integracja do genomu. W przenoszeniu omawianego fragmentu do wnętrza komórek roślinnych biorą udział również geny położone w regionie vir plazmidu oraz część genów znajdujących się w chromosomie bakterii.
  • transfekcja komórek roślinnych bez udziału wektorów. W metodzie tej prowadzi się inkubację protoplastów roślinnych i przeprowadzonego do postaci liniowej plazmidowej cząsteczki DNA, w której umieszczono marker selekcyjny. Inkubacja musi odbywać się, w takich warunkach, które pozwolą na pobranie DNA. Można ją prowadzić np. w obecności glikolu polietylenowego w środowisku zasadowym. Inkubacja może być poprzedzona elektroporacją czyli poddaniem protoplastów roślinnych działaniu krótkotrwałych impulsów elektrycznych o wysokim napięciu. Jeszcze inną metodą, pozwalającą wprowadzać transgeny bez użycia wektorów jest mikroiniekcja czyli bezpośrednie wprowadzanie cząsteczek DNA do jądra komórkowego. Często używa się specjalnie skonstruowanych do tego celu armatek genowych. Są to urządzenia wstrzeliwujące niewielkie wolframowe kuleczki pokryte transgenami do wnętrza komórek. Nieco łagodniejszą metodą jest transfekowanie przy pomocy liposomów. Są one pęcherzykami utworzonymi z warstwy lipidów, we wnętrzu których umieszcza się zrekombinowane DNA. Warstwa lipidowa zapewnia kwasom nukleinowyn ochronę przed atakiem wewnątrzkomórkowych nukleaz i łatwo integruje się z błoną protoplastu.

Sukcesy na polu inżynierii genetycznej roślin:

  • zmiany dokonane w metabolizmie roślin umożliwiły zwiększenie ich trwałości. Uzyskano w ten sposób m.in. niegnijącego pomidora. W tym przypadku zastosowano strategię antysensu czyli wprowadzono do komórki antysensowne cząsteczki RNA. Cząsteczki te mają sekwencję komplementarną sekwencji do genu, którego ekspresję chce się wyłączyć. Tu antysensowne RNA miało wyciszyć ekspresję genu kodującego enzym poligalakturonazę. Po dokonaniu tego typu zmiany, w czasie transkrypcji powstaje w komórce właściwa cząsteczka mRNA, która dalej ulegałaby translacji do poligalaktouronazy oraz antysensowny mRNA. Oba fragmenty łączą się ze sobą w wyniku czego powstają dupleksy uniemożliwiające biosyntezę enzymu i owoc pomidora ma znacznie spowolnione procesy dojrzewania. Innym sposobem pozwalającym uzyskać podobny efekt jest ingerencja w reakcje , podczas których syntetyzowany jest etylen. Służy temu kosupresja. Do genomu rośliny wprowadza się dodatkową kopię genu natywnego i w miejsce nasilonej ekspresji zauważyć można efekt wyciszenia, prowadzący aż do całkowitego wygaszenia syntezy etylenu. Tą metodą otrzymano goździki o spowolnionym procesie więdnięcia.
  • stosowanie roślin w funkcji bioreaktorów, w których syntetyzowane są białek heterologiczne. Jest to podyktowane wieloma zaletami. Wśród nich wymienić należy m.in. stosunkowo niskie koszty i wysoką wydajność procesu pozyskiwania białka. Tą metodą można uzyskać cząsteczki hormonów wzrostu, interleukiny, przeciwciała, czy cytokiny.
  • wytwarzanie nowych odmian roślin, mogą one posiadać inne niż dotychczas spotykane kolory, odmienne kształty, odróżniać się właściwości wzrostu. Tak powstały m.in. pomarańczowe odmiany petunii (do ich genomów wprowadzono geny kodujące antocyjaniny pochodzące z komórek kukurydzy, a do transformacji wykorzystano Agrobacterium ) i ziemniaki, które mogą spełniać funkcję roślin ozdobnych.
  • uzyskanie roślin wykazujących zwiększoną odporność na infekcje - dzięki temu uzyskuje się większe plony, wyższą jakość i intensywniejszy wzrost w porównaniu z normalnymi roślinami. Najczęściej tego typu modyfikację uzyskuje się przeprowadzając infekcję rośliny takim szczepem wirusowym, który wywołuje u niej chorobę o bardzo łagodnym przebiegu, a jednocześnie nadaje odporność na zakażenie dziką odmianą wirusa. Alternatywną metodą jest transfekcja genami warunkującymi ekspresję białek obecnych w płaszczu określonej odmiany wirusa np. mozaiki tytoniowej.
  • oporność na ataki owadów. Jest to warunkowane ekspresją toksyny produkowanej przez bakterie należące do gatunku Bacillus thuringiensis. Ten wariant zastosowano w komórkach bawełny. Natomiast do komórek tytoniu wprowadzono inhibitor proteaz serynowych, uzyskując identyczny efekt.
  • oporność roślin na herbicydy. Można ją otrzymać trzema metodami: wymuszając zwiększoną produkcję enzymu, który jest unieczynniany przez określony herbicyd, uzyskując ekspresja zmutowanych cząsteczek ego enzymu, tak aby nie mógł na nie działać herbicyd i wreszcie uzyskując ekspresja cząsteczek innego enzymu, znoszącego toksyczne działanie herbicydu.

TRANSGENICZNE ZWIERZĘTA.

Zwierzęta transgeniczne, analogicznie do roślin, ssą osobnikami, którym obce geny trwale wprowadzono do komórek generatywnych, czyli komórek rozrodczych.

Obecnie znane są trzy metody dzięki którym można je uzyskać:

  • mikroiniekcja odpowiednich fragmentów cząsteczek DNA do jednego z przedjądrzy zygoty, przeprowadzana w warunkach in vitro, przed momentem, w którym nastąpi jej pierwszy podział,
  • wprowadzenie do młodego zarodka zrekombinowanego wektora wirusowego,
  • dokonanie manipulacji genetycznych w pierwotnych komórkach pozyskanych z węzła zarodkowego, a następnie ponownym wprowadzeniu ich do zarodka, znajdującego się w fazie blastocysty. Komórki izolowane z węzła zarodkowego mogą się różnicować do każdego typu komórek.

Jeśli podobnym zabiegom podda się dorosłą mysz, to będziemy mieć wówczas do czynienia z chimerą. Mianem chimery określa się osobniki niejednolite pod względem genetycznym, w których część komórek posiada odmienny zestaw chromosomów lub genów niż pozostałe.

Pierwszym zwierzęciem, któremu wprowadzono transgen była mysz. Do jej komórek wprowadzono gen kodujący hormonu wzrostu szczura.

Istnieją takie transgeny, które mogą zostać włączone wewnątrz struktury określonych genów. Powoduje to jego inaktywację czyli tzw. knock-out. Dzięki temu uzyskuje się zwierzęta nie wykazujące ekspresji pewnych typów genów, na których można badać rolę kodowanych przez nie białek w różnych procesach życiowych.

Myszy z knock-out'em genowym mogą być wykorzystywane jako zwierzęce modele chorób ludzkich. Tego typu badania mają niezwykłą wartość jeśli chodzi o zgłębianie mechanizmów wywołujących dane schorzenie oraz w poszukiwaniu właściwych metod leczenia. Jako przykład można podać transgeniczne myszy z knock-out'em genu rag-2 (kodującego aktywator rekombinazy 2). Zwierzęta te nie mogą wytwarzać limfocytów typu T oraz B. Jest to model SCID. Wyhodowano również myszy z knock-out'em w genie dla interferonu i interleukin.

Podobne eksperymenty przeprowadzono także na owcach, królikach oraz świniach. Poważnym czynnikiem ograniczającym okazała się tu częstość uzyskiwania zwierząt transgenicznych. Jedynie u 1 z pośród 200 zwierząt, w przypadku których zastosowano metodę mikroiniekcji transgenu do jaja próba kończyła się sukcesem. W przypadku myszy proces ten kończy się sukcesem mniej więcej od 10 do 15 razy częściej.

Jedną z gałęzi biotechnologii, na którą łoży się dziś duże nakłady finansowe jest klonowanie zarodków ssaków. Metoda ta pozwala na otrzymanie wielu jednakowych osobników. Metody te wzbudzają bardzo duże zainteresowanie między innymi u hodowców, pragnących pozyskać możliwie największą liczbę osobników posiadających pożądane cechy.

Klonowanie zarodków można przeprowadzić na wiele sposobów:

  1. Izolacja blastomerów.

Blastomery powstają podczas zachodzenia kolejnych podziałów zapłodnionej komórki jajowej. Na początku wszystkie są identyczne i mogą się różnicować do każdego typu komórki. Oznacza to mniej więcej tyle, że na tym etapie rozwoju z każdego z blastomerów może się rozwinąć cały organizm. Dotychczas eksperymenty prowadzono wyłącznie do momentu, w którym z zygoty powstało osiem blastomerów. Metodę tą należy dostosować do gatunku.

  1. Agregacja blastomerów.

Jest to modyfikacja wyżej omówionej metody. Tu jeden z blastomerów otacza się innymi, zwiększając tym samym możliwość powstania węzła zarodkowego. Aby do tego doszło konieczna jest obecność określonej masy komórek. Metoda ta nie znalazła użytecznego zastosowania.

  1. Bisekcja zarodków.

Ta odmiana jest zdecydowanie najpowszechniejsza. Wykorzystując metody mikrochirurgii rozdziela się tu zarodki, będące w stadium morulli, czy blastocysty na dwie części.

  1. Transplantacja jąder izolowanych z komórek zarodka.

Jedynie tą metodą można uzyskać większą liczbę klonów. Istotą tej metody jest usunięcie obu przedjądrzy z zygoty albo chromosomów z nie zapłodnionych jeszcze oocytów, po to aby w to miejsce wprowadzić jądra wyizolowane z blastomerów zarodków. Można do tego celu zastosować metody fuzji komórek, elektrofuzji lub metodą transplantacji mikrochirurgicznej.

Każdą ze wspomnianych metod stosowano aby klonować owce, króliki, czy myszy. Trzeba jednak zaznaczyć, iż manipulacji tych dokonywano w komórkach embrionalnych, czyli niezróżnicowanych, a więc totipotencjalnych.

Zdecydowanie inną metodą klonowania są eksperymenty, w czasie których próbuje się zastosować komórki uzyskane z dorosłych ssaków. Tą właśnie metodą sklonowano znaną na całym świecie owcę - Dolly. Była to pierwsza, udana próba uzyskania klonu przy wykorzystaniu w pełni zróżnicowanych komórek. Materiał genetyczny wyizolowano z komórek somatycznych jednej dorosłej owcy, a następnie zastąpiono nim jądro komórkowe z komórki innej owcy. Całość zaimplantowano w macicy kolejnej. Niestety cześć osób podchodzi do tego osiągnięcia sceptycznie. Głównym powodem jest niemożność powtórzenia eksperymentu. Wiadomo również, że Dolly powstała po wykonaniu trzystu podobnych, nieudanych doświadczeń. Z taką samą częstotliwością występują w tkankach dorosłych osobników komórki totipotencjalne. Możliwe więc, że Dolly powstała właśnie z tego typu komórki. Technika ta niesie ze sobą duże ryzyko wystąpienia deformacji w trakcie rozwoju i jest zdecydowanie zbyt mało wydajna, aby mogła być zastosowana na szeroką skalę. Jak widać droga prowadząca do osiągnięcia sukcesu w dziedzinie klonowania jest jeszcze bardzo długa. Niemniej jednak wyzwanie zostało podjęte.