Klonowanie jest to technika, która służy do powielania fragmentów DNA, które dają się wyizolować w bardzo małych ilościach. Fragment obcego DNA, który zostaje wprowadzony do komórki gospodarza z wektorem i ulega replikacji a więc namnaża się wraz z komórkami swojego gospodarza. Metody te są wykorzystywane do uzyskiwania zwielokrotnionej liczby genetycznie identycznych komórek, zarodków lub organizmów roślinnych czy zwierzęcych i nazwane są klonowaniem. Są to również metody otrzymywania identycznych kopii genów i konstrukcji genowych. Najlepiej opracowane jest klonowanie drobnoustrojów i jest ono równoznaczne z klonowaniem komórek. Polega ono ma namnażaniu przez podziały mitotyczne specjalnie wybranych komórek bakteryjnych w odpowiednich pożywkach.

KLONOWANIE DNA

Klonowanie DNA polega na wyizolowaniu odcinków DNA przy pomocy różnych wektorów, którymi mogą być plazmidy, wirusy czy sztuczne chromosomy. Muszą one mieć dodatkowo zdolność do samodzielnej replikacji w komórce bakteryjnej bądź eukariotycznej. Klonowanie DNA przebiega w kilku etapach. Pierwszym etapem jest dobranie odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, który ciąłby fragmenty DNA przeznaczone do klonowania a także przecinałby DNA plazmidów. Po dobraniu takiej restryktazy enzym ligaza musi złączyć ze sobą uprzednio pocięte fragmenty. Powstają tutaj też cząsteczki zrekombinowanego DNA, w których fragment klonowanego DNA jest włączony do plazmidu. Następnie tak zrekombinowany plazmid zostaje wprowadzony do bakterii na drodze transformacji. Bakterią tą jest zazwyczaj Escherichia coli. W kolejnych podziałach bakteria wytwarza klon komórek, z których każda zawiera zrekombinowane plazmidy z klonowanym DNA. W ten sposób powstają banki DNA organizmów, z których można namnożyć dowolne ilości określonych fragmentów DNA. Klonować można zarówno losowo pocięte fragmenty DNA jak i ściśle określone odcinki między innymi geny. Obecnie DNA można powielać bez klonowania go w komórkach, ale stosując technikę łańcuchowej reakcji polimerazy.

Klonowanie genów jest bardzo użyteczną techniką, która odgrywa ogromną rolę w badaniach biologicznych dotyczących różnych dziedzin. Jedną z nich jest identyfikacja genów związana z procesami chorobowymi. Dzięki klonowaniu można zidentyfikować nieprawidłowe geny wywołujące liczne choroby dziedziczne takie jak np. hemofilia czy dystrofia mięśniowa. Można też rozpoznać onkogeny i geny supresorowe, które maja istotny wpływ na rozwój nowotworów. Scharakteryzowanie tych genów przyczyniło się w bardzo, znaczny sposób do poznania procesów chorobowych. Inną techniką jest mapowanie genomu, która przyczynia się do identyfikacji i charakterystyki klonów zawierających sekwencję sąsiadujących ze sobą regionów w chromosomach. Jest ona wykorzystywana do konstruowania map, które pozwalają na ustalenie względnych pozycji genów. Klonowanie genów wykorzystuje się do produkcji dużych ilości białek stosowanych w medycynie takich jak insulina podawana chorym na cukrzycę czy czynnik VII stosowany w leczeniu hemofilii. Geny, które kodują poszukiwane białka klonuje się w wektorach ekspresyjnych wprowadzanych do organizmu odpowiedniego gospodarza jak np. drożdże, które mają zdolność do wytwarzania dużych ilości produktów ekspresji wklonowanych genów. Klonowanie wykorzystuje się w celu przeniesienia do organizmu obcych genów, co prowadzi do uzyskania roślin i zwierząt zmodyfikowanych genetycznie.

KLONOWANIE GENÓW

Klonowanie genów polega na wyizolowaniu genów za pośrednictwem różnych wektorów, które mają zdolność do przeprowadzania samodzielnej replikacji DNA. Klonowanie genów przebiega w podobny sposób jak klonowanie różnych innych odcinków DNA. Jednak w klonowaniu genów konieczne jest wyizolowanie odpowiedniej sekwencji danego genu. Można to osiągnąć stosując rozmaite metody. Najprostszą z nich jest wyizolowanie kodowanych przez dany gen cząsteczek mRNA. Cząsteczki te są swoista sondą molekularną przy pomocy, której identyfikuje się komplementarną do niej sekwencje we fragmencie DNA metodą hybrydyzacji kwasów nukleinowych. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych polega na powstawaniu dwuniciowych struktur kwasów nukleinowych z cząsteczek, które są jednoniciowe o komplementarnych sekwencjach nukleotydów. Jeśli jedna z takich cząsteczek będzie oznakowana to powstanie sonda molekularna, która może posłużyć do identyfikacji genów w badanej próbce. Sady te mogą być znakowane radioaktywnie lub przy pomocy związków fluoryzujących oraz przez dołączenie do cząsteczki kwasu DNA dobrze znakującego się enzymu. Oznaczona w ten sposób sekwencja odpowiada poszukiwanemu genowi. Jeśli zaś nie ma cząsteczek mRNA ale znany jest skład aminokwasów białka kodowanego przez dany gen to na podstawie znajomości kodu genetycznego można określić przypuszczalna sekwencję DNA lub mRNA, która koduje fragment tego białka. Następnie trzeba ją zsyntetyzować chemicznie i można użyć jej jako sondy molekularnej do identyfikacji genu. Znane są również inne metody do uzyskania genów do klonowania. Niezależnie jednak od sposobu pozyskania potrzebnego genu dalsze czynności polegające na złączeniu go z wektorem i wprowadzenie do komórki gdzie będzie replikował pozostają takie same. Powstałe banki sklonowanych genów służą jako źródło genów do badań naukowych i różnych manipulacji genetycznych np. do otrzymywania zwierząt transgenicznych.

KLONOWANIE KOMÓREK

Klonowanie komórek polega na uzyskiwaniu hodowli komórek z jednej komórki. W wyniku tego powstaje homogeniczna populacja komórek tzw. klon.

KLONOWANIE ROŚLIN

Klonowanie roślin kwiatowych jest prostą metodą polegająca na hodowli ich fragmentów, co jest równoznaczne z rozmnażaniem wegetatywnym lub polega na wyprodukowaniu organizmów z pojedynczych komórek. Komórki, które zostaną pobrane od rośliny przenosi się do sztucznych hodowli. W wyniku podziałów rozwijają się zespoły komórek niezróżnicowanych, które mają zdolność do różnicowania się i rozwijania w dorosłe rośliny. Cechują się one znacznie mniejszą zmiennością osobniczą niż populacje, które reprodukują się w sposób naturalny. Dzięki klonowaniu roślin można pominąć naturalny cykl rozmnażania i znacznie szybsze uzyskanie bardziej wartościowych odmian.

KLONOWANIE ZWIERZĄT

W wypadku organizmów wielokomórkowych pewne sukcesy uzyskano w klonowaniu płazów dopiero w latach 70 - tych XX w. Sklonowane ssaki zaczęły się pojawiać jeszcze później. W klonowaniu płazów zastosowano metodę pozwalająca na uzyskanie kopii larwy płazów, czyli kijanek identycznych pod względem genetycznym. Metoda ta polegała na pobraniu jądra komórkowego z komórki organizmu larwy, czyli z komórki wyspecjalizowanej i pełniącej daną funkcję w organizmie. Następnym krokiem było przeniesienie jądra do komórki jajowej, którą wcześniej pozbawiono jej własnego jądra. Zrekombinowana komórka jajowa rozwija się następnie w zarodek, który przemienia się w larwę. Zabieg ten jest stosunkowo trudny do wykonania gdyż w większości przypadków zarodki umierają. W latach 70 - tych otrzymano kilkanaście larw, które były kopiami kijanki Xenopus laevis. Kilka z nich rozwinęło się w osobniki dojrzałe, co było ogromnym sukcesem. Eksperyment ten dowiódł, że genomy zawarte we wszystkich komórkach organizmu są równowartościowe.

Również w latach 70 - tych XX wieku udało się skolonować dojrzały organizm żaby. Pierwszym ssakiem, który był identyczna kopią dorosłego osobnika była owca Dolly. Sklonowano ją w 1997 roku w Institute of Animal Physiology and Genetic Research w Roslin koło Edynburga.

Klonowanie dorosłych organizmów zwierzęcych jest to metoda pozwalająca na uzyskanie kopii dojrzałego organizmu zwierzęcego identycznego pod względem genetycznym. Klonowanie to polega na pobraniu jądra komórkowego z komórki dojrzałego organizmu tzn. z komórki wyspecjalizowanej pełniącej określoną funkcje w organizmie i przeniesieniu go do komórki jajowej lub do zygoty. Oczywiście komórka jajowa jak i zygota musiały być wcześniej pozbawione własnego jądra komórkowego. Komórka jajowa czy zarodek po zrekombinowaniu rozwija się w zarodek a następnie w organizm dojrzały. Metoda ta jest bardzo trudna do wykonania a poza tym w większości przypadków zarodki wcześnie umierają.

Sklonowanie owcy polegało na pobraniu z komórek sutka dojrzałego zwierzęcia jądra komórkowego, które zostało wprowadzone do pobranej od innej owcy komórki jajowej, z której zostało usunięte jądro. Następnie Zrekombinowana komórkę jajową utrzymywano w sztucznej hodowli. Wykształcony w ten sposób wielokomórkowy zarodek przeniesiono do organizmu zastępczej matki, która urodziła prawidłowo rozwiniętą owcę Dolly. W drugiej połowie 1997 roku na Uniwersytecie w Honolulu Sklonowano myszy. W 1988 roku ponownie sklonowano te myszy i tym samym potwierdzono, że możliwe jest uzyskanie linii klonów.

Procesem naturalnym, w którym powstają, co najmniej dwaj identyczni pod względem genetycznym ludzie jest powstanie bliźniąt jednojajowych, monozygotycznych. Sztuczne klonowanie człowieka jest w fazie prób i budzi bardzo wiele kontrowersji. Dotychczasowe osiągnięcia w zakresie klonowania zarodków różnych gatunków ssaków takich jak np. myszy, króliki, kozy, owce, świnie, bydło, konie oraz sklonowanie dorosłej owcy pozwala sadzić, że pewne metody mikromanipulacji mogłyby doprowadzić do uzyskania klonów ludzkich. Takie klony można by uzyskać przez rozdzielenie zarodka ludzkiego w stadium dwu blastomerowego a także prawdopodobnie cztero i ośmioblastomerowego a następnie umieszczenie ich w macicach kobiet przygotowujących się do ciąży lub podzielenie zarodka w stadium moruli lub blastocysty na dwie lub więcej części i umieszczenie ich w macicach kobiet. Następnym etapem byłoby pobranie jądra z komórki zarodka i przeniesienie go do pozbawionego własnego jądra oocytu lub do pozbawionej jądra komórki jajowej. Kolejną czynnością jest pobudzenie go do rozwoju i umieszczenie w macicy. Alternatywa do tej metody może być pobranie jądra z komórki dojrzałego organizmu i przeniesienie go do pozbawionego własnego jądra oocytu lub komórki jajowej i pobudzenie go do rozwoju w macicy. Dwie pierwsze metody przypominają procesy zachodzące w trakcie rozmnażania zwierząt. U ssaków naturalne powstawanie bliźniąt jednojajowych w warunkach samoistnego rozdzielenia się zarodków w stadium blastocysty. Zastosowanie kolejnych dwóch metod powodowałoby powstanie potomstwa o genotypach będących dokładnymi kopiami dawców jąder.

Dotychczas jedna z prób sklonowania człowieka odbyła się w 1993 roku. Dwaj naukowcy Hall i Stillman z Uniwersytetu w Waszyngtonie oznajmili światu, że rozdzielili blastomery kilkukomórkowego zarodka ludzkiego i pobudzili go do rozwoju. Jednak zarodki te rozwijały się nieprawidłowo. Po sklonowaniu owcy Dolly, czyli klonowaniu dorosłych organizmów zwierzęcych wielu biologów jest zdania, że w najbliższym czasie będzie można sklonować dorosłego człowieka. Jednak taka perspektywa budzi wiele kontrowersji i sprzeciwów. Przeciwnicy klonowania podkreślają szczególna pozycję człowieka jako gatunku i chcą ustawowego zakazu ingerowania w genom ludzki. W 1997 roku w Paryżu 186 państw członków UNESCO zadeklarowało, iż nie będzie stosowało praktyk genetycznych w stosunku do ludzi. Rok później w Paryżu 19 państw należących do Rady Europy podpisało dokument zakazujący klonowania istot ludzkich. Tekst tego dokumentu jest protokołem do europejskiej Konwencji o Ochronie Praw Człowieka Wobec Zastosowań Biologii i Medycyny. Dokument ten nazwany jest też konwencją z Oviedo i zastrzega, że do wykonywania wszelkich eksperymentów i badań genetycznych potrzebna jest zgoda tych, których te badania dotyczą. Nie można też prowadzić do dyskryminacji wynikającej z właściwości genetycznych, które muszą być objęte ścisła tajemnicą. Dopuszcza się prowadzenia badań na genomie ludzkim tylko i wyłącznie dla celów prewencyjnych, diagnostycznych lub terapeutycznych.

Klonowanie transgenicznych ssaków polega na wyprodukowaniu klonów osobników, które miałyby jednakowe, ale celowo zmienione przez człowieka genomy. Pierwszymi sklonowane transgenicznie ssaki to owce, które uzyskano w 1997 roku. Powstały one w tym samym instytucie, w którym wcześniej Sklonowano pierwszego nietransgrnicznego ssaka. Aby sklonować takiego transgenicznego ssaka badacze musieli pobrać komórki z płodu owcy i hodować je pozaustrojowo. Następnie do hodowanych komórek wprowadzili ludzki gen, który kieruje produkcją czynnika IX, czyli czynnika krzepliwości krwi. Jego niedobór wywołuje chorobę zwana hemofilią. Z hodowli wyselekcjonowano tylko te komórki, w których stwierdzono integrację wprowadzonego genu z materiałem dziedzicznym. Natomiast od owiec, które były dawczyniami pobrano komórki jajowe i usunięto z nich jądra komórkowe. Takie wyizolowane jądra komórkowe z transformowanych komórek płodowych wprowadzono do pozbawionych jądra komórek jajowych. Zmodyfikowane komórki jajowe zostały wprowadzone do jajowodów owiec, które są matkami zastępczymi. W wyniku przeniesienia transformowanych komórek jajowych urodziło się sześć jagniąt. U trzech z nich stwierdzono występowanie ludzkiego genu odpowiedzialnego za produkcje czynnika IX. Jedno z jagniąt niestety padło a dwa pozostałe nazwano Molly i Polly. Obecnie czynnik IX otrzymuje się z ludzkiego osocza krwi. Dla jednej chorej osoby w ciągu roku potrzeba minimum 500 litrów osocza tzn., że musi pochodzić ono od około 1000 dawców. Jeszcze innym sposobem jest produkcja tego czynnika przez bakterie transgeniczne. Jedyną wadą tej metody jest to, że jest ona bardzo droga. Klony transgenicznych samic ssaków a zwłaszcza te o dużej wydajności mlecznej, czyli krowy produkują mleko zawierające białko potrzebne do otrzymania czynnika krzepliwości krwi w dużych ilościach. Jeszcze jedną ważną zaleta tej metody jest to, że czynnik ten jest łatwy do wyizolowania. W przyszłości na pewno zostaną podjęte próby klonowania dorosłych osobników transgenicznych, które sprawdziły się pod względem cech użytkowych.

Klonowanie zarodków pozwala na uzyskanie zwielokrotnionej liczby genetycznie identycznych zarodków. Klonowanie zarodków bezkręgowców jak i kręgowców przeprowadzane jest przez rozdzielenie blastomerów zarodków dwu, cztero- i ośmiokomórkowych. Dodatkowo u ssaków stosuje się dzielenie zarodków lub transplantację jąder komórkowych zarodków. Proces rozdzielenia blastomerów u ssaków rozpoczyna się od usunięcia z zarodka osłony przejrzystej. Kolejne kroki zalezą od stadium, w jakim znajduje się zarodek. Rozdzielenia zarodków blastomerów składających się z dwóch komórek przeprowadza się za pomocą mikropipety w specjalnie przygotowanym środowisku płynnym. Zazwyczaj jest to specjalna pożywka. Rozdzielenie blastomerów zarodków cztero i ośmiokomórkowych wymaga wcześniejszej inkubacji w pożywkach, które nie zawierają jonów wapnia i magnezu, w temperaturze 370C, przez około 15 - 20 minut. Następnie takie blastomery można stosunkowo łatwo rozdzielić przy pomocy mikropipety gdyż wiązania międzykomórkowe są znacznie osłabione. Hodowlę in vitro wyizolowanych blastomerów prowadzi się do momentu osiągnięci przez nie odpowiedniego stadium tzn. stadium moruli lub blastocysty. Wtedy to zarodki mogą być przeniesione do matek biorczyń i umieszczone w ich macicach. Możliwości rozwojowe wyizolowanych blastomerów są bardzo różne u różnych gatunków ssaków. Pełną zdolność rozwojową wykazały blastomery zarodków dwukomórkowych myszy, szczura, kozy, królika, owcy, świni, bydła, konia i pawiana zaś ośmiokomórkowe rozwinęły się w pełni u myszy, kozy, owcy i bydła. Klonowanie zarodków przez rozdzielenie polega na chirurgicznym rozcięciu zarodka na dwie połowy, które są komplementarne. Dzięki tej metodzie można uzyskać dwa jednakowe zarodki, czyli bliźnięta monozygotyczne. Metodę taką zastosowano z powodzeniem u ssaków takich jak: myszy, króliki, owce, świnie i konie.

Inną metodą jest metoda transplantacji jąder polegająca na przeniesieniu jąder komórkowych uzyskanych z jednego zarodka będącego w stadium moruli lub blastuli do oocytów, zygot lub blastomerów tego samego gatunku, zwierzęcia, z którego wcześniej usunięto jądra. W ten sposób można uzyskać od jednego do nawet kilkudziesięciu klonów genetycznie identycznych z zarodkiem, czyli dawcą jąder komórkowych. Już w latach 50 - tych XX wieku dzięki tej metodzie uzyskano klony żab. W 1997 roku po raz pierwszy sklonowano zarodek ssaka a rok po tym zdarzeniu przyszedł na świat w laboratorium w Stanach Zjednoczonych byczek rasy Holstein nazwany Jeffersonem. Klonowanie zarodków wykorzystuje się do celów badawczych, do uzyskania licznego potomstwa zwierząt o szczególnej wartości użytkowej oraz do rozmnażanie osobników gatunków zagrożonych i ginących.

Dzięki rozwojowi wielu gałęzi nauk genetycznych człowiek ma możliwość ingerencji w strukturę genową komórki czy organizmu i zablokowanie, zlikwidowanie lub zmienienie funkcji określonego odcinka DNA a tym samym genu czy genów. Może to prowadzić do trwałej tzn. dziedzicznej zmiany w funkcjonowaniu genomów. Modyfikacje genetyczne organizmów żywych przeprowadzane są przez człowieka z wykorzystaniem konwencjonalnych metod hodowlanych takich jak selekcja czy krzyżowanie. Manipulacje genetyczne przeprowadzane przy użyciu technik rekombinacji DNA. Polegają one na wprowadzeniu do organizmu jednokomórkowego lub do komórek organizmu wielokomórkowego a także do komórki jajowej, zygoty czy komórek zarodka ściśle określonego odcinka DNA tak, aby wywołać trwałą, dziedziczna zmianę w cechach biorcy. Zazwyczaj metody te polegają na pobraniu DNA od dawcy, czyli dowolnego organizmu i wycięciu przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych wybranego fragmentu DNA. Następnie fragment ten jest przenoszony do komórek biorcy. Jednymi z najstarszych metod przenoszenia informacji genetycznej jest włączanie fragmentów DNA do niewielkich cząstek DNA, które wykazywały zdolności autonomicznej replikacji. Spełniały również funkcję przenośników, które po wprowadzeniu do komórki biorcy umożliwiały wbudowanie się w jej genom innych obcych genów. Następnie namnażały się one w wyniku podziałów komórki biorcy. Obecnie stosuje się inne metody przenoszenia genów np. organizmy zrekombinowane, organizmy transgeniczne, terapię genową. Metody inżynierii genetycznej początkowo objęły bakterie i drożdże obecnie zaś obce geny wprowadza się do drobnoustrojów zmuszając je niejako do produkcji obcych białek wykorzystywanych np. do produkcji leków. Przykładem takim może być produkcja insuliny na skalę przemysłowa przez zrekombinowane klony bakteryjne. Otrzymywanie insuliny z trzustek zwierzęcych jest bardzo kosztowne i niestety nie zaspokaja potrzeb. Obecne metody inżynierii genetycznej doprowadziły do wyhodowania zwierząt transgenicznych i roślin transgenicznych.

Zawierają one w swych komórkach włączony do chromosomów gen pochodzący z obcego organizmu. Organizmy takie otrzymuje się przez mikroiniekcję do jednego z jąder dwujądrowej zygoty (w hodowli in vitro) obcego genu, który był wcześniej sklonowany. Następnie zygotę taką wprowadza się do macicy zastępczej matki, w której następuje jej dalszy rozwój. U roślin obcy gen najczęściej wprowadza się za pomocą wektora plazmidowego z bakterii Agrobacterium tumefaciens i z transformowanej komórki regeneruje się całą roślinę. Do tej pory wyprodukowano transgeniczne odmiany takich roślin jak: rzepak, kukurydza, ryż, pszenica, jęczmień, soja, fasola, bawełna, pomidor, ziemniak, maniok, orzech ziemny, topola, dynia, burak cukrowy, trzcina cukrowa, słonecznik. Prace nad roślinami transgenicznymi trwają cały czas i próbuje się uzyskać rośliny o coraz lepszych cechach. Za pomocą technik inżynierii genetycznej otrzymano już rośliny, które są odporne na owady, infekcje wirusowe i herbicydy. Duże nadzieje wiąże się z wyhodowaniem roślin transgenicznych, które przyczyniłyby się do zwiększenia produkcji żywności. Należy jednak pamiętać, że w wielu bogatych krajach jest wielu przeciwników wykorzystania roślin transgenicznych do produkcji żywności. Uważają oni, że nie można do końca przewidzieć, jakie skutki dla organizmu człowieka mogłoby mieś spożywanie takiej żywności.

Pierwszym transgenicznym zwierzęciem była mysz z wprowadzonym genomem hormonu wzrostu szczura. Takie transgeniczne myszy wykorzystuje się jako model do badania niektórych chorób występujących u człowieka np. dystrofii mięśniowej, albinizmu, mukowiscydozy, anemii sierpowatej, choroby Alzheimera. Metody transgeniczne stosuje się do otrzymania zwierząt o znaczeniu gospodarczym np. w celu zwiększenia masy ciała, mleczności, odporności na niektóre choroby. Próby takie przeprowadza się głównie na królikach, owcach, bydle, świniach, rybach i kurczakach.

Inżynieria genetyczna stwarza również możliwości łączenia ze sobą różnych genów, które w komórkach biorcy staną się matrycą do syntezy RNA i następnie białek. Prowadzi to do modyfikacji organizmów żywych i ma ogromne znaczenie dla rozwoju biologii, pozwalając na dokładne poznanie funkcji ściśle określonych fragmentów DNA. Metody te maja również bardzo duże znaczenie praktyczne gdyż umożliwiają produkowanie określonych białek przez organizmy, które w naturalny sposób nie są do tego zdolne. Pojawia się również problem potencjalnych możliwości i wynikających z tego zagrożeń. Budzi to oczywiście wiele niepokoju i nieustannie prowadzone są dyskusje natury etycznej. W 1975 roku postanowiono zaprzestać bardziej niebezpiecznych doświadczeń np. z bakteriami, które produkują groźne toksyny oraz opracować bardzo szczegółowo szereg norm obowiązujących przy posługiwaniu się metodami inżynierii genetycznej. Część krajów opracowała swoje wewnętrzne zasady regulujące kontrowersyjne problemy.