Inżynieria genetyczna, czyli modyfikowanie genomu organizmu, tak zwierzęcego jak i roślinnego ma na celu poznanie podstawowych procesów życiowych i ich mechanizmów, a także późniejsze wykorzystanie tej wiedzy w celach praktycznych, tak by służyły człowiekowi. Tak jest w przypadku modyfikowania roślin o znaczeniu gospodarczym. Dużym zainteresowaniem cieszą się badania nad różnicowaniem się komórek i następnie tkanek roślinnych, a także rolą światła, jako czynnika wpływającego na ekspresję określonych genów.
Pożądane geny, które chcemy umieścić w genomie danego organizmu muszą być przeniesione do jego komórki przez specjalne przenośniki, zwane wektorami, którymi mogą być wirusy, fagi, kosmidy lub plazmidy. W przypadku roślin z tylko jednej, genetycznie zmodyfikowanej komórki możemy otrzymać w warunkach sztucznych całą, nową roślinę. Proces taki nie jest możliwy w przypadku organizmów zwierzęcych.
Często w badaniach nad roślinami do przenoszenia genów do komórek roślinnych stosuje się wektory plazmidowe. Plazmidem jest fragment pozachromosomowego DNA bakterii, który replikuje się także niezależnie. Przykładem może być plazmid bakterii Agrobacterium tumefaciens, która jest pasożytem roślin, a przekazując do komórek łodygi plazmidowy DNA powoduje tworzenie się narośli. Dzieje się tak, ponieważ część DNA bakterii (plazmidowego) zostaje włączona do genomu rośliny, w wyniku czego powstaje anomalia rozwojowa jaką jest właśnie narośl. Będąc naturalnym przykładem przekazywania DNA plazmidowego do roślin, naukowcy postanowili wykorzystać tę bakterię. Poprzez odpowiednie modyfikowanie plazmidowego DNA A. tumefaciens wprowadzają do niego odpowiednie geny, a następnie do rośliny docelowej. W konsekwencji powoduje to wbudowanie zmodyfikowanego przez naukowców genu do rośliny, wywołując tym samym pożądaną zmianę i obserwując później jej efekty. W ten sposób otrzymano rośliny transgeniczne, które tworzyły zdrowy pyłek, komórkę jajową, a po zapłodnieniu nasiona, które mogły się w naturalny sposób rozmnażać, a jednocześnie nosiły obce geny. Geny odpowiadające za odporność na pasożyty, wirusy wprowadzono do roślin uprawnych. Intensywne prace trwają nad pszenicą i kukurydzą, do których wprowadzono takie geny, ale wciąż trwają testy. Do roślin uprawnych wprowadza się także geny, które przyczyniłyby się do zwiększenia plonów, co byłoby dużym osiągnięciem w dobie wciąż rosnącej liczby ludności na Ziemi, która już nie jest jej w stanie wyżywić.
W komórkach zwierzęcych naukowcy próbują zmieniać kolejne sekwencje DNA, tak by mogło ono kodować określone białka w dużych ilościach, a co ważne niezanieczyszczone. Ciekawym tematem, interesującym naukowców jest także wpływ takiego zmienionego białka, produkowanego przez komórkę na samą komórkę, jej funkcjonowanie, a wreszcie, jaki ma to wpływ na cały organizm. Tym sposobem dowiadujemy się jakie podłoże i mechanizm mają procesy fizjologiczne organizmu oraz co jest przyczyną stanów patologicznych. To właśnie wprowadzanie określonych, obcych fragmentów DNA do materiału genetycznego żywej komórki było wielkim osiągnięciem współczesnej inżynierii genetycznej. Wraz ze zmianami, jakie mają miejsce w nauce, zmienia się także oblicze współczesnej biologii, która z nauki, opisującej i badającej procesy i żywe organizmy, staje się nauką, która już nie tylko obserwuje, ale ingeruje w żywe organizmy na poziomie materiału genetycznego, tak by osiągnąć zamierzony cel.
Techniką wykorzystywaną powszechnie to zmieniania komórek bakterii, jak i komórek organizmów wyższych (eukarionty) jest wprowadzanie pożądanych genów poprzez wektory, do których przyłączone są fragmenty cDNA. W przypadku organizmów jednokomórkowych zmiany, jakie zachodzą w komórce dotyczą jednocześnie całego organizmu. Jest to rodzaj terapii genowej, której efekty widać bardzo szybko, ze względu na prostą budowę organizmu prokatiotycznego, natomiast wprowadzanie terapii genowej na szerszą skalę, stosując ją w organizmach wielokomórkowych, o zaawansowanym rozwoju i rozmnażających się płciowo (np. ssaki, czy człowiek) jest znacznie bardziej skomplikowane i wiąże się z wieloma przeszkodami. Może także przynieść nieoczekiwane efekty uboczne, które ujawnią się dopiero w działaniu całego organizmu, a nie były widoczne w przypadku pojedynczej komórki.
Dlatego też opracowuje się metody, które mogłyby temu zapobiec. Obecnie jedną z możliwości jest poddawanie zmianom modyfikacyjnym tylko komórek somatycznych. Cały proces przebiega w następujący sposób: pierwszy etap to pobranie komórek z organizmu, który chcemy zmienić, drugi, to umieszczenie ich w warunkach laboratoryjnych na pożywce, tak by mogły w jak najbardziej naturalnych warunkach rozwijać się i dzielić; następny etap polega już na wprowadzaniu odpowiedniego odcinka DNA przez wektor, a ostatnim etapem jest wprowadzanie tak zmodyfikowanej komórki z powrotem do organizmu macierzystego. Jest to jeden ze sposobów, który może wkrótce stać się metodą terapii genowej, stosowanej u ludzi z chorobami o podłożu genetycznym. Komórkami stosowanymi w eksperymentach są komórki pochodzące ze szpiku kostnego, które zawierają komórki dające początek elementom morfotycznym krwi. Takie eksperymenty przeprowadzane są na szeroką skalę, wykonując później próby na chorych. Dość obiecujące efekty widoczne są u dzieci z niedoborami immunologicznymi (ciężki, złożony niedobór odporności), których źródłem jest wada genetyczna. W tym przypadku wadę powoduje homozygotyczność organizmu, czyli obecność dwóch zmutowanych alleli tego samego genu, który odpowiada za kodowanie dezaminazy adenozynowej, która jest kluczową molekułą, wpływającą na aktywność limfocytów. Leczenie polega na wprowadzaniu allelu niezmutowanego do limfocytów. Podobnie sprawa ma się z innymi chorobami, których efektem są zaburzenia związane z funkcjonowaniem krwinek; terapia mogłaby się opierać właśnie na wprowadzaniu do nich prawidłowego genu. Jak dotąd trwają dopiero badania laboratoryjne, a jeśli ich rezultaty będą na tyle dobre, by wprowadzić je w fazę testów klinicznych, będzie to oznaczało następny krok we wprowadzaniu terapii genowej w życie codzienne.
Taka terapia z nieco dalszej perspektywy jest jedynie doraźnym leczeniem, które wprawdzie może uratować życie, ale nie wprowadza zmian dziedzicznych, ponieważ zmodyfikowane zostały komórki somatyczne, a nie rozrodcze. Zmian w komórkach rozrodczych dokonywano jak dotąd tylko w nielicznych przypadkach zwierząt laboratoryjnych, tj. muszki owocowej, czy niewielkich ssakach, a także na roślinach.
W przypadku Drosophila melanogaster (muszka) wprowadzanie nowych genów odbywa się poprzez transpozony. Są to ruchome fragmenty DNA, które mogą zmieniać swoje położenie, mogą one wywoływać także inne mutacje w genomie, wykorzystywane mogą być do lokalizowania określonych genów na chromosomach, a także nieść cechy. W eksperymentach z muszką używa się jako wektora transpozonu P. Wstrzykuje się go do zarodków znajdujących się na wczesnym etapie rozwoju, z których później rozwijają się organizmy, zawierające transpozon P, który przekazywany jest później następnemu pokoleniu.
Zarówno zmodyfikowane genetycznie muszki, jak i inne organizmy, do których genomów wprowadzono obce fragmenty DNA, który następnie może być przekazywany kolejnym pokoleniom, nazywane są organizmami transgenicznymi. Metody takie stwarzają ogromne możliwości poznawania mechanizmów dziedziczenia, ich sedna, a także procesów różnicowania się komórek, a następnie ich rozwoju i w rezultacie rozwoju całego organizmu. Wszystko jednak ma swój początek w materiale genetycznym i biologii molekularnej. Bardzo interesującym zagadnieniem jest ekspresja poszczególnych genów i czynniki ją warunkujące. Przykładem może być wpływ sekwencji DNA, które otaczają pewien gen i wpływają na jego ekspresję. Można zauważyć różnice ekspresji po wprowadzeniu nowego genu (transgenu), który ulokowany jest w genomie w miejscu innym niż jego naturalny odpowiednik. Ponadto zauważono, że w kilku różnych, niezależnych od siebie eksperymentach umieszczania tego samego transgenu w genomie muszki, za każdym razem umieszczany jest on w innym miejscu, nawet na innych chromosomach. I tutaj pojawiają się pytania o czynniki regulatorowe, które niezbędne są do funkcjonowania transgenu i jego ekspresji. Kolejnym pytaniem jest, czy umieszczenie transgenu na ściśle określonym chromosomie, w ściśle określonym miejscu wpływa ma znaczenie, a jeśli tak, to jakie i jak wpływa to na jego ekspresję.
Podobne pytania dotyczą także eksperymentów wprowadzania transgenów do komórek linii płciowej ssaków. Tak zmutowane myszy laboratoryjne, do których wprowadzano różne geny są doskonałym materiałem badawczym, pozwalającym na analizowanie wielu problemów badawczych z najróżniejszych dziedzin biologii. Oprócz myszy badania prowadzi się także na innych ssakach, np. na świniach, królikach, czy owcach, w poszukiwaniu odpowiednich gatunków, które można byłoby wykorzystać do produkcji różnego rodzaju białek wykorzystywanych w medycynie.
Tak popularne dziś we wszystkich laboratoriach badawczych transgeniczne myszy otrzymuje się na kilka sposobów, ale jeden z nich jest wykorzystywany na szeroką skalę. Odbywa się to poprzez wprowadzenie zmienionego genu do jądra komórki jajowej, którą wcześniej poddaje się zapłodnieniu. Kolejnym krokiem jest wprowadzenie tak przygotowanego jaja do macicy myszy, gdzie następnie rozwija się zarodek. Ponieważ transgen został wprowadzony do jaja zaraz po zapłodnieniu, organizm, który się z niego rozwinie będzie posiadał ten gen zarówno w komórkach somatycznych, jak i komórkach rozrodczych, a zatem dany gen przekazywany będzie kolejnym pokoleniom. Te kolejne pokolenia poddawane są licznym badaniom, sprawdzając ekspresję transgenu i jej miejsce, a także wszelkie zaburzenia, które może powodować w organizmie dodatkowy gen. Elementy regulujące ekspresję transgenu zazwyczaj połączone są z nim, ale dla celów badawczych można je połączyć z innym genem, dodatkowo je znakując, lub połączyć z genem, który koduje produkty, które są łatwo wykrywalne w komórce. Później fragment DNA, do którego przyłączone są czynniki regulatorowe łączą się z sekwencją kodującą, by zapewnić jej prawidłową ekspresję, w wyniku czego powstają swego rodzaju mieszane geny, które nie są spotykane naturalnie w przyrodzie.
Transgeniczne organizmy stały się obecnie ważnym elementem w nowoczesnej medycynie i innych badaniach biologicznych. Jak ważne miejsce one zajmują może świadczyć choćby przykład genu, kodującego wytwarzanie przez komórkę insuliny. Ekspresja owego genu może być ograniczana przez fragment DNA znajdujący się bezpośrednio przed nim, a proces ten zachodzi tylko w niektórych komórkach trzustki. Eksperyment przeprowadzony z tymi komórkami, polegał na wprowadzeniu do zarodków mysich fragmentu DNA, który złożony był z fragmentu, kodującego onkogen wirusa SV40 i fragmentu, będącego sekwencją regulatorową dla genu kodującego produkcję insuliny. Tak przygotowany fragment DNA, po wprowadzeniu dziedziczony był przez osobniki potomne. Fragment kodujący onkogen kontrolowany jest przez promotor dla genu kodującego produkcję insuliny, a zatem nie będzie on mógł być produkowany w innych komórkach, niż te, które syntezują insulinę. Jak się okazało później, właśnie w tych komórkach zachodziły zmiany nowotworowe, które prowadziły do powstania charakterystycznych nowotworów, które nazwano wyspiakami. Ostatecznymi wnioskami było stwierdzenie, że geny regulatorowe dla sekwencji kodujących produkcję insuliny, zapewniają ekspresję jakiegokolwiek genu, ale tylko w komórkach produkujących insulinę.
Podobnie sprawa wygląda z wykorzystaniem regulatorów genu, który koduje syntezę elastazy. Elastaza jest enzymem produkowanym także przez trzustkę, ale synteza zachodzi już w innych komórkach, niże te, które produkują insulinę. W eksperymencie wykorzystano również wspomniany wyżej onkogen wirusa SV40. Mimo, że użyto tego samego onkogenu, wywoływał on zmiany nowotworowe w komórkach, produkujących elastazę, a nie insulinę. A zatem wniosek jest prosty: powstawanie nowotworu, czyli ściślej, ekspresja genu kodującego jego powstawanie uzależniona jest od genów regulatorowych, które są z nim "związane".
Badania takie w dużym stopniu przyczyniły się do poszerzenia wiedzy o mechanizmach powstawania nowotworów, co wykorzystywane jest o udoskonalania i tworzenia nowych środków farmakologicznych przeciwko nim. Myszy z celowo zmienionym materiałem genetycznym wykorzystywane są w farmacji także do testowania nowych leków stosowanych w przypadku nowotworów. Bada się przede wszystkim działanie unicestwiające na komórki rakowe, czy powstrzymywanie ich namnażanie się, ale także wpływ leków na cały organizm i efekty uboczne, jakie może powodować.
Oprócz wprowadzania nowych genów do gnomów komórek, po to by komórka, lub cały organizm wykazywał nową, niewystępującą wcześniej cechę wprowadza się także transgeny do komórek ssaków, by poznać funkcje poszczególnych genów. Wprowadza się także transgeny do fragmentów DNA, które są kluczowe dla rozwoju organizmu. W związku z tym, że nawet naukowcy przeprowadzający eksperyment nie mają wpływu na to, gdzie dany transgen zostanie włączony w genomie, właśnie ta zależność wykorzystywana jest do badań nad wpływem lokalizacji tego genu na jego ekspresję. Badane są także te sekwencje DNA pierwotnego, w których umieszczony został transgen. W taki sposób można też identyfikować geny, które odgrywają znaczącą rolę w rozwoju organizmu. Jest to możliwe, kiedy transgen włączony zostanie we fragment DNA, na którym znajdują się właśnie takie kluczowe geny, lub też geny regulatorowe ważnego dla rozwoju genu. Wówczas taki gen z transgenu ulega mutacji. Powoduje to widoczne zmiany w funkcjonowaniu organizmu. Zwykle nie ulega on ekspresji, a co za tym idzie, nie wytwarzane jest kodowane przez nie białko, które często jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu. Ponadto powstająca mutacja w tym genie nie jest zależna od ekspresji transgenu, który ją wywołał.
Mutacje najczęściej wywoływane były sztucznie poprzez insercję, a stosowano ją najczęściej u zbóż uprawnych, drożdży, czy bakterii. Do tego celu wykorzystywano elementy ruchome, natomiast w eksperymentach na myszach do tego celu wykorzystuje się transgeny. Innym źródłem mutacji, które będą przekazywane kolejnym pokoleniom są infekcje retrowirusów, które mają miejsce we wczesnych fazach rozwoju zarodków. Wówczas, kiedy fragment materiału genetycznego wirusa zostanie wbudowany w genom młodego zarodka, w miejscu, gdzie znajduje się gen, jego ekspresja jest zazwyczaj zaburzona w mniejszym lub większym stopniu. Zaburzenia takie mogą zarówno powodować osłabienie ekspresji genu, czy jej całkowite zablokowanie, jak i jej wzmocnienie. Takie mutacje wywołane w okolicach onkogenu mogą wzmocnić jego ekspresję, co powoduje powstawanie nowotworu.
Po wyhodowaniu pierwszego pokolenia, które posiada w swoim genomie transgen, są to zwykle organizmy heterozygotyczne, pod względem tego transgenu, ale przeprowadzając chów wsobny (krzyżowanie osobników blisko spokrewnionych) można otrzymać początkowo niewiele, a później coraz więcej osobników homozygotycznych. U takich osobników bardzo dobrze widać wszystkie efekty, cechy, które kodowane są przez transgen. Poprzez dalsze badania genów, w których nastąpiła insercja transgenu (zwłaszcza tych kluczowych dla prawidłowego rozwoju) można wnioskować na temat mutacji, które powodują zaburzenia rozwojowe, identyfikować i izolować takie zmutowane geny, (które we wczesnych fazach rozwoju zarodkowego są letalne i powodują usunięcie zarodka z organizmu matki) i być może w przyszłości przy zastosowaniu terapii genowej leczyć je, lub nawet zapobiegać ich powstawaniu.
