Inżynieria genetyczna.

Modyfikacje genetyczne organizmów roślinnych

Inżynieria genetyczna roślin, tak jak i zwierząt ma na celu poznanie mechanizmów rządzących podstawowymi procesami życiowymi. W przypadku organizmów roślinnym kwestie o pierwszorzędnym znaczeniu dotyczą różnicowania się tkanek w zarodku oraz wpływ promieniowania słonecznego na ekspresję poszczególnych genów. Bardzo ważną częścią badań genetycznych nad roślinami stanowi modyfikowanie gnomów roślin istotnych gospodarczo (kukurydza, pszenica, ryż). Geny odpowiedzialne np. za odporność na choroby grzybicze wprowadzane są do komórek rośliny przez użycie specjalnych nośników, czyli wektorów, którymi mogą być wirusy, plazmidy, czy kosmidy. Tylko z jednej komórki roślinnej, która nie musi być komórką zarodkową można otrzymać całą roślinę, co w przypadku zwierząt jest w naturze niemożliwe, a czego udało się dokonać poprzez sztuczne klonowanie zwierząt.

W badaniach na roślinach wykorzystuje się różnego rodzaju wektory, które niosą obcy fragment DNA, ale częściej niż inne wykorzystywane są plazmidy komórek bakteryjnych. Przykładem, który występuje w naturze jest przekazywanie plazmidu bakterii Agrobacterium tumefaciens roślinom w miejscu zranienia, co w rezultacie prowadzi do powstania narośli. Plazmid jest to wolny fragment DNA znajdujący się w jądrze poza chromosomami, i który dziedziczy się niezależnie. Po dostaniu się plazmidu do komórki roślinnej zostaje on wbudowany do DNA komórki roślinnej. Nawet z tak zmienionych komórek można otrzymać zupełnie zdrowe rośliny. Jako, że jest to dobrze poznany i naturalny przykład wprowadzania obcego DNA do komórek roślinnych, został on wykorzystany przez naukowców. Wprowadzając obce geny do plazmidowego DNA metodami inżynierii genetycznej można je wprowadzić do komórek roślinnych, gdzie zostaną wbudowane, a roślina posiadać będzie pożądane cechy kodowane przez wprowadzone nowe geny. Geny, które najczęściej się wprowadza do roślin o dużym znaczeniu gospodarczym to geny odporności na szkodniki, różnego rodzaju choroby i geny zwiększające plonowanie, co jest niezmiernie ważne w rozwiązywaniu problemu wyżywienia wciąż rosnącej liczby ludzi na Ziemi. Do gnomów roślinnych wprowadza się także odpowiednio zmodyfikowane geny, odpowiedzialne za poprawę wartości odżywczych, produkcji pewnych substancji użytkowych przez komórki roślinne, które wcześniej nie były przez nie syntezowane, czy zwiększenie produkcji pewnych witamin.

Modyfikacje genetyczne organizmów zwierzęcych

Modyfikowanie organizmów zwierzęcych dotyczy przede wszystkim wprowadzania odpowiednich genów, które odpowiedzialne są za kodowanie odpowiednich białek, tak, by organizm wytwarzał je w zwiększonych ilościach. Badania prowadzone są także nad tym jak wprowadzenie obcego genu lub genów wpływa na organizację materiału genetycznego, podział komórki, która została zmieniona, a także na cały organizm. Obserwując te skutki można wyciągnąć wnioski na temat prawidłowych i patologicznych czynności fizjologicznych organizmu, które są skutkiem określonej, jednostkowej zmiany. To właśnie wprowadzanie do komórek bardzo specyficznych genów, które znane są przed wprowadzeniem umożliwiło takie obserwacje. I w takim momencie rozważań na temat inżynierii genetycznej, która jest częścią biologii można zauważyć jak nauka ta zmieniła się w niedługim czasie przechodząc od obserwacji i opisywania morfologii i czynności życiowych organizmu do wprowadzania zmian poprzez ingerencję w materiał genetyczny tego organizmu.

Sama technika przeprowadzania eksperymentów modyfikowania materiału genetycznego komórek eukariotycznych i prokariotycznych opiera się na wprowadzaniu cDNA, czy inny określony fragment DNA do komórki poprzez związanie go z wektorem. Działanie takie dokonywane na komórkach organizmów jednokomórkowych (bakterie, drożdże) powodują zmiany, które łatwo zaobserwować, w związku z tak prostą budową, ponieważ działanie na jedną komórkę, jest w rzeczywistości oddziaływaniem na cały organizm. Dlatego też wprowadzanie zdrowego genu w miejsce nieprawidłowego u tych organizmów można nazwać to terapią genową. Ale terapia genowa u organizmów bardziej złożonych, wielokomórkowych, rozmnażających się płciowo nie jest już takie proste i niesie ze sobą wiele niewiadomych, może nieść także wiele zmian w funkcjonowaniu całego organizmu, których naukowcy nie są w stanie przewidzieć zmieniając pojedyncze komórki. Wymaga to, zatem stosowanie nieco innych metod i technik przeprowadzania takich eksperymentów.

Jedną z metod modyfikacji jest wprowadzanie poszczególnych genów tylko do komórek somatycznych, które są już zróżnicowane. Polega to na początkowym pobraniu komórek z organizmu, który poddawany jest eksperymentowi, następnie wstępnej hodowli tych komórek w warunkach laboratoryjnych na pożywce, gdzie podlegają podziałom i rozwojowi. Następnie przechodzi się do zasadniczej części eksperymentu, czyli do wprowadzenia odpowiedniego odcinka obcego DNA, połączonego ze specjalnym nośnikiem (wektorem) do komórek. Później komórki umieszcza się ponownie w organizmie, z którego były one pobrane. Takiego typu technika ma szansę być wykorzystana w przypadku terapii genowych stosowanych u ludzi, a z którymi obecnie wiąże się duże nadzieje, w związku z licznymi chorobami, spowodowanymi zaburzeniami w genomie. U ssaków często wykorzystuje się komórki, które pobierane są ze szpiku kostnego, a które zawierają także komórki dające początek elementom upostaciowionym krwi. W transformacjach komórek zwierzęcych stosuje się kilka technik, ale najczęściej do wprowadzania nowych genów wykorzystuje się materiał genetyczny retrowirusów jako wektor. Dużym zainteresowaniem wśród naukowców cieszą się badania, które dały już bardzo dobre rezultaty, a które dotyczą dzieci cierpiących na ciężki złożony niedobór odporności. Ten zespół chorobowy w głównej mierze uzależniony jest od enzymu - dezaminazy adenozynowej. Osoby chore cierpią na brak tego enzymu, ponieważ posiadają w swoim genomie dwa zmutowane allele (są to homozygoty pod względem tego genu), kodujące syntezę owego enzymu. Sama terapia miałaby polegać na wprowadzaniu do limfocytów chorego prawidłowego genu. Pierwsze próby, jakie przeprowadzono na dzieciach przyniosły oczekiwane rezultaty i pozwoliły na ich normalne funkcjonowanie.

Zmiany wprowadzane w zróżnicowanych komórkach somatycznych organizmów nie są jednak przekazywane kolejnym pokoleniom, ponieważ komórki linii płciowej różnicują się bardzo wcześnie w rozwoju. Dlatego też, aby wprowadzane zmiany w genomie były dziedziczne, należy je zastosować właśnie w komórkach płciowych. Badanie takie są jak na razie przeprowadzane na zwierzętach laboratoryjnych, m.in. na myszach, królikach, czy popularnej w badaniach genetycznych muszce owocowej (Drosophila melanogaster). W tym ostatnim przypadku zmiana DNA polega na wprowadzeniu nowego genu za pomocą transpozonu, który zwany jest elementem P. Transpozony są ruchomymi elementami DNA, które mogą się przemieszczać w obrębie genomu, ale i mogą wywoływać różnego rodzaju mutacje. Za pomocą elementu P, w którym umieszcza się odpowiedni gen, a następnie całość łączy się z odpowiednim wektorem wprowadza się ten gen do zarodków, znajdujących się w początkowych etapach rozwoju. Następnie gen zostaje wbudowany w DNA komórki, a rozwijające się z zarodków młode organizmy zazwyczaj wykazują już cechy, za które odpowiada nowo wprowadzony gen. Co ważne cecha ta przekazywana jest następnym pokoleniom, ponieważ znajduje się on także w komórkach linii płciowej.

Zarówno muszki, jak i inne organizmy, do komórek których wprowadzono nowe geny, a które mogą być przekazywane w procesie rozmnażania, są to organizmy tzw. transgeniczne. Nowy gen, lub wprowadzane geny nazywa się transgenami. Badanie takie oprócz stwarzania ogromnych możliwości w leczeniu wielu chorób o podłożu genetycznym, pozwalają także na poznawanie mechanizmów procesów rozwojowych organizmów i różnicowania się komórek. Przykładem mogą być badania, które analizują wpływ odcinków DNA, które otaczają dany gen na jego ekspresję. Jest to szczególnie ważne, ponieważ wprowadzając nowe geny, czy, co ważniejsze zastępując poszczególne, zmutowane geny ich zdrowymi odpowiednikami nie mamy wpływu na docelową lokalizację wprowadzanego genu, co oznacza, że może on zostać wbudowany w różnym od pierwotnego miejscu genomu. A zatem bardzo ważne jest zbadanie wpływu sekwencji otaczających wprowadzany gen. Mogą mieć one kluczowe znaczenie w ekspresji tego genu, ale mogą one nie odgrywać ważniejszej roli. W przypadku, kiedy wpływ taki byłby bardzo widoczny, mogłoby to wywołać nieprzewidziane skutki takiej terapii genowej, lub też całkowicie zahamować ekspresję, a wprowadzony gen, nie wykazywałby żadnej aktywności. W rezultacie oba przypadki byłyby przykładem zniweczonych wysiłków naukowców. Ważne jest także, by poznać znaczenie położenia transgenu i otaczających go sekwencji w komórkach różnego typu, a także w poszczególnych fazach rozwojowych.

Oprócz wprowadzania genów do gnomów komórek płciowych muszki owocowej, wprowadzono je także do komórek ssaków. Myszy modyfikowane genetycznie, posiadające pożądane, specyficzne cechy wykorzystywane są szeroko w badaniach laboratoryjnych nad rozmaitymi zagadnieniami biologii. Takim zmianom poddaje się także inne ssaki, m.in. świnie, króliki, chomiki itp. Wszystko to w celu otrzymania jak najlepszych rezultatów w produkcji określonych białek w czystej postaci i w dużych ilościach na potrzeby medycyny i nie tylko. Myszy zmodyfikowane genetycznie otrzymywać można w laboratoriach kilkoma metodami, ale i tu najbardziej efektywna okazała się metoda polegająca na wprowadzaniu transgenów do komórki jajowej organizmu, którą wcześniej poddano zapłodnieniu. Następnie komórkę taką umieszcza się w macicy myszy, gdzie w naturalny sposób rozwija się. W tym czasie wprowadzony gen zostaje wbudowany w genom zarodka. Wprowadzając transgen w tak wczesnej fazie rozwoju mamy pewność, ze wbudowany on zostanie w genom komórek somatycznych jak i komórek linii płciowej, a kolejne pokolenia będą dziedziczyć cechy, które koduje owy gen. W przypadku kolejnych pokoleń, podlegają one szczegółowym badaniom pod względem ekspresji transgenu, jego umiejscowienia w genomie i jaki może mieć to wpływ na komórkę. Wprowadzany transgen zawiera także odcinki regulatorowe, ale korzystne z naukowego punktu widzenia jest łączenie tych odcinków z innymi genami, które dają później łatwo wykrywalne produkty, przez co łatwiej je zidentyfikować. W ten sposób można także obserwować mechanizmy włączania i ekspresji genów. Ważne w badaniach jest także obserwowanie wpływu białka kodowanego przez wprowadzony transgen na cały organizm, nie tylko na komórkę, która go produkuje. W takim przypadku, by było to łatwo wykrywalne, wprowadzany odcinek DNA, kodujący daną cechę łączy się z takim odcinkiem regulatorowym, który przyczyni się do ekspresji tego genów.

Eksperymenty z wykorzystaniem transgenicznych zwierząt laboratoryjnych przyczyniają się do rozwiązania licznych problemów biochemicznych, a także do wyjaśnienia procesów mających miejsce nie tylko w obrębie genomu. Ważną kwestią, było odkrycie wpływu sekwencji DNA umieszczonych w najbliższym sąsiedztwie transgenu na jego ekspresję. Przykładem takiego wpływu może być regulacja ekspresji genu kodującego syntezę insuliny. Jest ona hamowana przez pewien odcinek DNA, który znajduje się nad tym genem, a aktywny jest tylko w wybranych komórkach trzustki. Przeprowadzono więc eksperyment, który miał wyjaśnić cały mechanizm rządzący tym zjawiskiem. Polegał on na połączeniu onkogenu wirusa SV40 z sekwencją regulatorową, zapewniającą ekspresję genowi kodującemu insulinę. W związku z obecnością tego odcinka regulatorowego, wiadomo jest, że onkogenu będzie aktywny tylko w komórkach, które syntezują insulinę. Efektem takiego eksperymentu było powstawanie zmian nowotworowych tylko w komórkach trzustki, a nowotwory nazwano wyspiakami. Dowodzi to także, że sekwencje regulatorowe mają kluczowe znaczenie dla ekspresji genów i związane są z określonym typem komórek. Podobne wyniki otrzymano stosując, w zamian za odcinki regulatorowe odpowiadające genom insulinowym, sekwencje regulatorowe elastazy (enzym syntezowany w innych komórkach trzustki). Tego rodzaju badania pozwoliły naukowcom na dokładniejsze zbadanie problemu powstawania nowotworów, a transgeniczne myszy stosuje się w eksperymentach, których celem jest znalezienie skutecznego lekarstwa zwalczającego nowotwory.

Mutacje - sztuczne wywoływanie i skutki

Poza wprowadzaniem obcych genów do komórek roślinnych czy zwierzęcych, by wywołać określony efekt, polegający na wykazywaniu danej cechy lub odwrotnie, inną metodą ludzkiej ingerencji w genom roślin czy zwierząt jest "wstawianie" transgenu w odcinek DNA, na którym znajdują się geny kluczowe dla rozwoju organizmu. Badania takie mają na celu wyjaśnienie znaczenia umieszczenia transgenów w różnych miejscach w genomie, (ponieważ wiadomo, że mogą się one włączać w miejsca zupełnie losowe), także w odcinek DNA, na którym znajdują się ważne geny. Istotny jest także wpływ lokalizacji transgenu na samym chromosomie i wpływ sekwencji DNA, które znajdują się w pobliżu transgenu na jego ekspresję (nasilenie lub wyciszenie). Ma to szczególne znaczenie, właśnie wtedy, kiedy transgen zostanie przypadkowo włączony w rejon z genami kodującymi ważne dla rozwoju białka. Niekiedy takim miejscem jest też odcinek DNA, na którym znajdują się nie mniej ważne geny regulatorowe. Jeśli się tak stanie gen pierwotny ulega mutacji, niezależnie od ekspresji transgenu (może być ona zupełnie wstrzymana, ale wywołuje zaburzenia strukturalne). Zazwyczaj takie mutacje oznaczają brak lub upośledzoną syntezę jakiegoś ważnego białka, którym może być np. enzym, co prowadzi w konsekwencji do poważnych zaburzeń w rozwoju oraz późniejszym funkcjonowaniu całego organizmu.

W ten sposób naukowcy wprowadzają także celowo transgeny do określonych fragmentów DNA, by zaobserwować skutki takiej mutacji (insercja). Mutacji dokonuje się w przypadku myszy poprzez infekcję retrowirusową przeprowadzaną na zarodkach, we wczesnych fazach rozwoju. Następnie transgen wbudowany zostaje w genom zarodka. W przypadku, kiedy zostanie on wbudowany właśnie w takim kluczowym miejscu ekspresja genu leżącego w sąsiedztwie zostaje zaburzona. Niekiedy zdarza się, ze transgen zostanie wbudowany w okolicy onkogenu, co często powoduje wzmocnienie jego ekspresji, czego skutkiem jest powstanie zmian nowotworowych.

Myszy transgeniczne, które rozwinęły się z zarodka, który poddany został modyfikacji posiadają transgen tylko w jednym chromosomie z pary, dlatego też zmiany, jakie wywołuje transgen nie zawsze są dobrze widoczne u takich myszy. Ale drogą chowu wsobnego można otrzymać myszy, które są pod względem transgen homozygotami, czyli zawierają dwa allele transgenu. U takich organizmów zmiany wywoływane przez transgen są wyraźnie widoczne. Wówczas kolejnym krokiem może być klonowanie takiego zmutowanego genu, co może później być użyteczne w identyfikacji takich zmutowanych sekwencji, odpowiedzialnych za poszczególne choroby, także w genomie ludzkim. Bardzo często identyfikacja takich genów jest czystym przypadkiem, takim samym jak pojawienie się właśnie w tym, określonym miejscu transgenu. Ale daje ona jednocześnie bardzo ważną wiedzę; znamy już przyczynę choroby, a zatem łatwiej o poszukiwanie skutecznego na nią leku. W tym przypadku, ażeby usunąć przyczyny choroby niezbędna byłaby ingerencja w materiał genetyczny, choć nie zawsze jest to możliwe, ponieważ np. wad w rozwoju nie można już cofnąć, co najwyżej można zadbać o to, by potomstwo nie było obciążone takim zmutowanym genem i zagrożone tą samą chorobą. Częstym przypadkiem jest, że mutacje w genomie wywołane przez insercję obcego fragmentu DNA w genom młodego zarodka powodują tak duże zmiany i zaburzenia rozwojowe, że są one letalne, a zarodek lub płód usuwany jest z organizmu matki bardzo szybko. Dlatego też trwają intensywne badania, głównie na myszach, by móc takim sytuacjom zapobiegać, lub w przypadku poważnych chorób, by można je było skutecznie leczyć, za pomocą przyszłościowej terapii genowej.