Pierwszy mikroskop został wynaleziony w XVII w. Było to rewolucyjne odkrycie dla nauki, gdyż wreszcie pojawiła się możliwość oglądania tego, co do tej pory było niedostrzegalne. Jednak w miarę postępu nauki mikroskop świetlny okazał się wynalazkiem niewystarczającym w stosunku do nieskończenie wielkich potrzeb badaczy. Wyjściem okazało się tu odkrycie w 1931 roku mikroskopu elektronowego przez Knoll'a i Ruskę. Już w 1934 roku Ruska osiągnął na swoim mikroskopie zdolność rozdzielczą 50 nm, a w 1936 roku firma Metroppolitan Vickers wyprodukowała pierwszy egzemplarz dla celów handlowych. Obecnie produkuje się trzy typy mikroskopów elektronowych: transmisyjny (TEM), skaningowy (SEM) i tunelowy. Ich granica rozdzielczości wynosi nawet około 0,2 nm.

Zasada działania mikroskopu elektronowego transmisyjnego.

Wykorzystywana jest tutaj wiązka elektronów, która przechodząc przez preparat tworzy obraz jego struktury wewnętrznej. Granica rozdzielczości wynosi w tym przypadku nawet 0,15 nm. Źródłem elektronów jest katoda wolframowa, natomiast cały system oświetlający składa się z trójelektrodowej wyrzutni elektronowej zawierającej katodę, cylinder Wehnelta oraz anodę. Katoda pozostaje pod wysokim ujemnym potencjałem w stosunku do uziemionej anody. Napięcie przyspieszające w TEM wynosi zwykle od 20 do 100 kV. Wyrzutnia elektronowa współpracuje z soczewką magnetyczną, zwaną kondensorem, przy czym może być to układ podwójny składający się z soczewki krótkoogniskowej i długoogniskowej. Zadaniem tego układu jest skupianie opuszczających działo elektronów. Powstaje więc wiązka elektronów, która prześwietla preparat, a następnie trafia w obręb działania pól soczewek elektronowych obiektywu i projektora. Powiększająca soczewka obiektywu wytwarza obraz pośredni w płaszczyźnie przedmiotowej drugiej soczewki (projektora), której zadaniem jest wytworzenie obrazu końcowego widocznego na ekranie pokrytym luminoforem. Obraz jest ostatecznie rejestrowany na płycie lub błonie fotograficznej. Mikroskop elektronowy pracuje w warunkach wysokiej próżni.

Zasada działania mikroskopu elektronowego skaningowego.

Źródłem elektronów jest tu także katoda wolframowa. Przyspieszone elektrony przechodzą przez otwór w anodzie, a następnie biegną przez pierwszą soczewkę redukcyjną, służącą do skupiania linii sił pola. W odróżnieniu od TEM pierwsza soczewka, zamiast tworzyć powiększony obraz redukuje wymiary źródła elektronów. Kolejne soczewki magnetyczne powodują jeszcze większą redukcję źródła (do 5000 razy). Dodatkowo biegnąca między soczewkami wiązka elektronowa poddawana jest działaniu pola magnetycznego, które powoduje jej odchylenie, w wyniku czego wiązka dokonuje analizy liniowej powierzchni badanego preparatu powodując wybicie elektronów wtórnych. Elektrony wtórne przyspieszane i wzmocnione przez kolektor są wykorzystywane jako sygnał dający informacje o danym punkcie preparatu. Sygnał ten trafia na siatkę sterującą lampy obrazowej monitora. SEM daje w porównaniu do TEM większą głębię ostrości, co pozwala na badanie preparatów o nierównej powierzchni. Jednak należy też zauważyć, iż mimo wszystko ma on gorsze zdolności rozdzielcze (około 10 nm).

Przygotowanie materiału biologicznego.

Materiał biologiczny przed analizą jego ultrastruktury w mikroskopie elektronowym wymaga odpowiedniej preparatyki. Małe obiekty, takie jak wirusy czy też cząsteczki chemiczne można badać po zastosowaniu cieniowania lub barwienia negatywowego, natomiast duże struktury wymagają zastosowania bardziej skomplikowanej techniki ultraskrawania, ewentualnie wykonania repliki powierzchniowej.

Przygotowanie małych obiektów biologicznych:

  • Cieniowanie - technika wykorzystująca metal ciężki, który zazwyczaj wyparowuje z punktowego źródła i pada skośnie na powierzchnię pokrytą fragmentami badanej próby.
  • Wybarwianie negatywne - polega na uwidacznianiu obrysów cząstek przez ich zatapianie w materiale gęstym elektronowo (np. kwas fosforowolframowy). Badane cząstki są wtedy widoczne jako obszary jasne na względnie ciemnym tle.

Przygotowanie dużych obiektów biologicznych:

  • Replika powierzchni - wykonywana jest przez napylenie na powierzchnię obiektu w warunkach próżni cienkiej warstwy łatwo przylegającego materiału o niskiej masie cząsteczkowej, np. węgla. Powstały w ten sposób bardzo cienki odcisk zdejmuje się, a następnie nakłada na zwykłą siateczkę mikroskopową.
  • Ultraskrawanie - jest to najbardziej użyteczna i najczęściej stosowana metoda. Polega ona na wykonaniu ultracienkich skrawków po uprzednim utrwaleniu materiału. Skrawki te poddaje się następnie kontrastowaniu.

W przypadku mikroskopu elektronowego skaningowego sposób przygotowywania preparatów jest różny w zależności od rodzaju badanego materiału. Wymagane jest aby powierzchnia preparatu przewodziła ładunek elektryczny, co uzyskuje się poprzez napylenie na nią cienkiej warstwy (ok. 20 nm) metalu ciężkiego (złota, palladu, srebra, chromu lub miedzi). Dodatkowo w przypadku materiału miękkiego należy go najpierw utrwalić i odwodnić, przy czym stosuje się tu te same techniki, co przy utrwalaniu preparatów do obserwacji w mikroskopie elektronowym transmisyjnym. Bardzo ważnym aspektem mikroskopii elektronowej skaningowej jest odporność materiału biologicznego na bombardowanie elektronami i warunki próżni, ponieważ dla prawidłowej obserwacji nie może ulec zniszczeniu struktura powierzchniowa obiektu.