ENZYMY RESTRYKCYJNE

Restryktazy (enzymy restrykcyjne, endonukleazy restrykcyjne) to wyizolowane z bakterii enzymy, które rozpoznają specyficzne sekwencje na nici DNA (zazwyczaj są to sekwencje palindromowe), a następnie przecinają dwuniciową cząsteczkę DNA w ściśle określonym miejscu, znajdującym się w obrębie lub w okolicy sekwencji rozpoznawanej. Po zastosowaniu restryktaz do wyizolowanego DNA i rozdzieleniu uzyskanych fragmentów za pomocą elektroforezy w żelu okazuje się, że ułożenie barwnych prążków nie jest losowe - w odpowiadających sobie prążkach uzyskanych na żelu pojawiają się cząsteczki DNA posiadające taką samą sekwencję nukleotydów. Zazwyczaj różne restryktazy rozpoznają odmienne sekwencje DNA. Wykryto jednak enzymy, które pomimo, że są różne i wyizolowane z różnych gatunków organizmów, rozpoznają identyczne sekwencje - nazwano je izoschizomerami. Istnieją również takie restryktazy, które rozpoznają różne sekwencje DNA, ale tną z utworzeniem takich samych lepkich końców. Daje to liczne możliwości w dziedzinie inżynierii genetycznej, np. przenoszenie fragmentów DNA pomiędzy różnymi cząsteczkami.

W nazewnictwie enzymów restrykcyjnych stosowane są literowe skróty (np. EcoRI). Pierwsza litera oznacza rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, druga i trzecia - gatunek, a kolejna z nich pochodzi od szczepu lub typu bakterii. Następujące po niej cyfry rzymskie odpowiadają kolejnym enzymom wyizolowanym z określonego szczepu.

Jedna jednostka enzymu restrykcyjnego oznacza taką jego ilość, która katalizuje kompletną hydrolizę wiązań w cząsteczce fagowego DNA o masie 1mg (ok. 50 kb) w czasie 1 godziny i w temperaturze 37°C.

Enzymy restrykcyjne pozostawiają dwa rodzaje końców w rozciętej cząsteczce DNA:

  • tępe końce - obie nici rozcięte są naprzeciwko siebie - nukleotydy znajdujące się na końcach są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnej nici;
  • lepkie końce - 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony występujące na obu końcach przeciętej niesymetrycznie cząsteczki, są one komplementarne do końców utworzonych w innych cząsteczkach DNA w wyniku zadziałania tych samych restryktaz, bez względu na źródło DNA, co umożliwia ligowanie DNA pochodzących nawet od bardzo różniących się gatunków (tworzenie cząsteczek chimerycznych).

Sposoby modyfikacji wolnych końców powstających po zadziałaniu enzymu przeprowadzane w celu przygotowania fragmentu DNA do klonowania:

  • tępe końce ulegają modyfikacji poprzez dołączenie cząsteczek adaptorowych (krótkie fragmenty DNA z jednej strony tępe, a z drugiej posiadające specjalnie przygotowane lepkie końce, właściwe dla danej restryktazy) bądź linkerów (zakończone tępo sekwencje łącznikowe zawierające miejsca cięcia dla określonych restryktaz); przed dołączeniem linkerów konieczna jest metylacja genomowego DNA przy użyciu odpowiedniej metylazy dla ochrony przed enzymem restrykcyjnym używanym do wytworzenia lepkich końców po przyłączeniu linkerów;
  • lepkie końce z wystającą nicią 5' wypełniane są za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy DNA I oraz kompletu nukleotydów, a powstające tępe końce ulegają dalszej modyfikacji;
  • z lepkich końców z wystającą nicią 3' ten jednoniciowy fragmentach usuwany jest przy pomocy nukleazy S1 lub nukleazy z fasoli mung - powstają tępe końce.

Podział restryktaz ze względu na rozpoznawaną sekwencję:

  • czwórkowe - rozpoznają czteronukleotydową sekwencję DNA; w cząsteczkach DNA jest wiele takich miejsc, średnio co 256 bp, dlatego tego rodzaju enzymy restrykcyjne trawią DNA na bardzo małe fragmenty;
  • szóstkowe - rozpoznają sekwencję DNA o długości sześciu nukleotydów; w cząsteczce DNA zawierającej równe ilości poszczególnych nukleotydów, takie miejsca restrykcyjne pojawiają się statystycznie co około 4096 bp, ale procentowe zawartości nukleotydów w DNA są różne w różnych organizmach, dlatego znalezienie odpowiedniego enzymu szóstkowego oraz warunków przeprowadzanej reakcji wymaga przeprowadzenia wstępnych eksperymentów;
  • ósemkowe - stosowane są niezbyt często, ponieważ cząsteczki DNA zawierają niewiele miejsc podatnych na działanie takich enzymów.

Zastosowanie enzymów restrykcyjnych:

  • Tworzenie map restrykcyjnych.

Mapa restrykcyjna to rozmieszczenie w DNA miejsc rozpoznawanych przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w liczbie nukleotydów. W celu utworzenia takiej mapy przeprowadza się trawienie DNA przy użyciu różnych restryktaz, stosowanych pojedynczo oraz w kombinacjach (w ilościach wystarczających lub niewystarczających do pełnego strawienia preparatu). Analiza produktów trawienia DNA rozdzielonych elektroforetycznie na żelu umożliwia ustalenie położenia oraz odległości pomiędzy sekwencjami wrażliwymi na działanie zastosowanych enzymów.

Fragmenty DNA uzyskane po cięciu enzymami restrykcyjnymi mogą zostać połączone z wektorem. Powstają wówczas zrekombinowane plazmidy (plazmidy zawierające pożądany fragment DNA), które można później klonować i po uzyskaniu odpowiedniej ilości, wykorzystywać w różnych manipulacjach na materiale genetycznym.

  • Badanie polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP).

Sposoby mechanicznej fragmentacji DNA :

  • Shearing przy użyciu strzykawki z igłą.

Preparat DNA przepuszczany jest za pomocą strzykawki przez igłę. Stopień jego fragmentacji jest zależny liczby przypuszczeń i od grubości igły. Cząsteczki DNA pękają najczęściej naprzeciwko siebie, dlatego uzyskiwane tą metodą fragmenty mają lepkie końce, różnią się także pod względem długości.

  • Sonikacja

Preparat DNA poddawany jest działaniu ultradźwięków, które powodują pękanie nici. Odpowiedni dobór warunków sonikacji oraz czasu jej trwania pozwalają na uzyskanie pożądanego stopnia fragmentacji DNA.

LIGAZY

Ligazy DNA to enzymy katalizujące tworzenie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy hydroksylowym końcem 3` a końcem 5' zawierającym resztę fosforową w DNA. Umożliwiają w ten sposób wypełnianie przerw powstałych na jednej nici dwuniciowego DNA oraz łączenie fragmentów DNA posiadających homologiczne lepkie lub tępe końce.

Najczęściej wykorzystywane są dwa enzymy: ligaza DNA z E. coli i ligaza DNA z faga T4. Tworzenie przez nie wiązań fosfodiestrowych jest w zasadzie odwróceniem reakcji trawienia restrykcyjnego, a ligaza faga T4 potrafi łączyć nawet tępe końce, jednakże z mniejszą wydajnością. Wadą jej jest mniejsza specyficzność w stosunku do struktury końców, co zwiększa ilość błędów w doświadczeniach, spowodowanych nieprawidłowymi ligacjami.