Enzymy restrykcyjne

Pod względem typu nacięć endonukleazy restrykcyjne wykazują dużą różnorodność. Przecięcie nici DNA może generować powstawanie: (a) lepkich końców 5', (b) lepkich końców 3' lub (c) tzw. tępych końców:

(a) EcoRI 5' G¯AATTC 3'

3' CTTAA­G 5'

(b) PstI 5' CTGCA¯G 3'

3' G­ACGTC 5'

(c)SmaI 5' CCC¯GGG 3'

3' GGG­CCC 5'

W wyniku zastosowania nieodpowiednich warunków reakcji może pojawić się niespecyficzna aktywność enzymu - tzw. "star activity". Czynniki powodujące star acitivity to:

  • zbyt wysokie stężenie enzymu w mieszaninie reakcyjnej
  • nieoptymalne pH;
  • obecność w mieszaninie reakcyjnej jonów Mn2+, zamiast Mg2+ (jony Mg2+ są niezbędne dla aktywności nukleaz);
  • zbyt niskie stężenie soli (w buforze powinien być zawarty 10mM Tris-HCl, który stanowi czynnik buforujący, często wymagana jest też obecność KCl);
  • obecność rozpuszczalników organicznych;
  • zbyt wysokie stężenie glicerolu (enzymy przechowuje się w temp -20 oC w glicerolu, jednak aby enzym działał prawidłowo końcowe stężenie glicerolu nie powinno przekraczać 5 %);
  • zbyt wysoka temperatura.

Brak działania enzymu może być wywołany m.in.: (i) metylacją DNA lub (ii) jego inaktywacją termiczną.

Inaktywacja enzymów restrykcyjnych po reakcji enzymatycznej:

  • inaktywacja termiczna (zwykle w temperaturze powyżej 65 oC);
  • denaturacja białek poprzez dodanie mieszaniny fenol:chloroform:Tris (po odbiałczeniu preparatu należy podda go precypitacji);
  • dodanie EDTA do stężenia końcowego 12,5 mM (następuje wymiareczkowanie jonów Mg2+).