Wiadomości ogólne

Chromatografia to metoda analityczna polegająca na rozdzielania substancji między dwie fazy, które się ze sobą nie mieszają. Proces rozdzielania jest ciągły, ma miejsce wielokrotni. Wspomniane wcześniej fazy różnią się m.in. wielkością. Faza stacjonarna charakteryzuje się duża powierzchnia i jest nieruchoma, zaś faza ruchoma jest mniejsza i przepływa wyłącznie w jednym i tym samym kierunku. Chromatografia jest znacznie lepsza metodą rozdzielania substancji niż np. destylacja czy ekstrakcja. Jeżeli faza ruchoma jest cieczą, to mamy do czynienia z następującymi technikami chromatograficznymi:

- chromatografia bibułowa;

- chromatografia cieczowa;

- chromatografia cienkowarstwowa;

- chromatografia jonowymienna.

Jeżeli fazą ruchoma jest gaz, to wówczas mamy do czynienia z chromatografią gazową.

Rozdział substancji wchodzących w skład badanej próbki ma miejsce dlatego, że substancje te mają różne współczynniki podziału pomiędzy faza stacjonarną i fazą ruchomą. Współczynnik podziału obliczamy w następujący sposób:

K = Cs/Cm

gdzie:

Cs to stężenie substancji w fazie stacjonarnej, zaś Cm to stężenie składnika w fazie ruchomej. Współczynnik podziału to wielkość charakterystyczna dla każdej substancji. W głównej mierze zależy od fazy stacjonarnej. Mamy do czynienia z równowagą dynamiczną. Proces migracji substancji ma miejsce tylko w fazie ruchomej. Do tego celu wykorzystywany jest eluent lub gaz nośny. Jeżeli współczynnik podziału jest bliski. 1, to oznacza że substancja przebywa dłużej w fazie stacjonarnej, później opuszcza kolumnę. Czas retencji zwiększa się. Należy wiedzieć, ze ustala się następujące fakty:

- nie ma miejsca dyfuzja;

- prędkość z jaka porusza się faza ruchoma ma wartość stałą;

- równowaga dynamiczna ustala się bardzo szybko;

Bardzo istotnym, wspomnianym wcześniej, pojęciem jest retencja. Prędkość z jaką porusza się składnik, a prędkość z jaką porusza się faza ruchoma różnią się między sobą. Dzieje się tak dlatego, że poszczególne składniki badanej próbki oddziałują z faza stacjonarną. Prędkość badanych składników jest mniejsza niż prędkość eluentu lub gazu nośnego. Gdy K zmierza do wartości 0, oznacza to, że składniki w badanej próbce nie oddziałują z faza stacjonarną. Taka substancja także potrzebuje określonego czasu do opuszczenia kolumny chromatograficznej. Czas od wstrzyknięcia do pojawienia się piku na rejestratorze nazywany jest zerowym czasem retencji. Zerowy czas retencji jest inny dla każdej substancji. Musimy go odjąć od całkowitego czasu retencji. Równanie retencji ma następującą postać:

Vr = Vm + KVs

gdzie:

Vr to objętość retencji

Vm to objętość ruchomej fazy

Vs to objętość fazy stacjonarnej

K współczynnik podziału.

Proces rozdzielenia substancji jest uzależniony od prędkości migracji. Po rozdzieleniu substancji bardzo ważnym elementem jest to, żeby substancje ponownie nie uległy zmieszaniu. Chromatograf, czyli wykres, który otrzymujemy po zarejestrowaniu rozdzielenia na rejestratorze, składa się z kilku pików.

Czas analizy przy użyciu chromatografu jest równy całkowitemu czasowi retencji ostatniej substancji na chromatografie.

To że dane substancje mogą rozdzielić się chromatograficznie bierze się stąd, że poszczególne substancje wchodzące w skład badanej próbki ulegają podziałowi w różnym stopniu. Podział ma miejsce pomiędzy dwiema nie mieszającymi się wzajemnie fazami. Obie fazy różnią się między sobą. Faza ruchoma nazywana jest eluentem, druga faza jest nieruchoma, nazywana jest fazą stacjonarną, i jej zadaniem jest wypełnianie kolumn chromatograficznych. Składniki wchodzące w skład badanej próbki poruszają się tylko będąc w fazie ruchomej, tzn. wraz z eluentem. Prędkość z jaką poruszają się składniki wchodzące w skład badanej próbki to funkcja podziału znajdująca się w stanie równowagi. Substancje charakteryzujące się większym powinowactwem do fazy nie zawierającej eluent, czyli fazy stacjonarnej, poruszają się znacznie wolniej, niż substancje, które wykazują powinowactwo do fazy zawierającej eluent, czyli fazy ruchomej. Rozdzielenie substancji zachodzące w kolumnie chromatograficznej wynika właśnie z różnic w szybkości poruszania, a co za tym idzie różnic w ilości tej samej substancji między dwiema fazami. W chemii mamy do czynienia z różnymi metodami chromatograficznymi. Najczęściej różnice pomiędzy nimi wynikają z różnych typów fazy stacjonarnej i fazy ruchomej. Chromatografia cieczowa charakteryzuje się tym, że faza ruchomą jest ciecz, zaś chromatografia gazowa charakteryzuje się tym, że faza ruchomą jest gaz. W ostatnich latach bardzo rozwija się chromatografia cieczowa. Polepszeniu wciąż są poddawane kolumny chromatograficzne, zaś szybkość migracji poszczególnych składników jest coraz większa. Obecnie jesteśmy w stanie rozdzielić bardzo wiele substancji, co kilka lat temu było niemożliwe do osiągnięcia. Wyróżniamy kilka typów chromatografii cieczowej. Najbardziej popularną jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC).

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest lepsza w stosunku do innych typów chromatografii cieczowej dlatego że: 

- stosowane kolumny w tej metodzie możemy stosować kilkukrotnie, nie musimy ich później regenerować;

- rozdzielenie w wysokosprawnej chromatografii cieczowej jest najlepsze w porównaniu z innymi metodami;

- otrzymane wyniki w metodzie wysokosprawnej chromatografii cieczowej nie sa uzależnione od sprawności obsługującej aparat. Operator nie odgrywa już takiej ważnej roli, jak w przypadku innych metod, co nie oznacza, że chromatograf HPLC może być obsługiwany przez nie przeszkolonego chemika;

- aparaty w wysokosprawnej chromatografii cieczowej są prawie w całości zautomatyzowane, co znacznie ułatwia analizę ilościową;

- czas przeprowadzanego doświadczenia w wysokosprawnej chromatografii cieczowej jest znacznie krótszy niż w przypadku innych metod.

Podział chromatografii cieczowej ze względu na typ wypełnień

Chromatografię cieczowa ze względu na typ wypełnień dzielimy na: 

1. Chromatografia podziałowa LLC (chromatografia ciecz-ciecz)

Ten typ chromatografii po raz pierwszy zastosowali Martin i Synge w roku 1941. Badanymi substancjami były ecetylowane aminokwasy. W chromatografii podziałowej LLC stosujemy ciekłe fazy stacjonarne. Są one w pewien sposób osadzone na obojętnych drobnoziarnistych nośnikach, mogą także być chemicznie związane z powierzchnią. Substancje wchodzące w skład badanej próbki i rozpuszczone w fazie zawierającej eluent (faza ruchoma) rozdzielają się na fazę stacjonarną i fazę ruchomą. Współczynnik podziału określa ilościowy rozdział danej substancji pomiędzy dwiema fazami. Składniki wchodzące w skład próbki różnią się między sobą współczynnikami podziału, a co za tym idzie migrują z różna prędkością wzdłuż kolumny chromatograficznej. W chromatografii podziałowej LLC fazę stacjonarna najczęściej tworzy polarna ciecz, taka jak np. woda, glikol. Faza ruchoma nie wykazuje polarności, może to być: heksan, chloroform, benzen. W przypadku, gdy faza stacjonarna nie wykazuje polarności, np. jest to węglowodór, zaś faza ruchoma jest polarna, np. jest to woda, to tego typu metodę nazywamy chromatografię z odwróconymi fazami.

Na szczególną uwagę zasługuje chromatografia PIC, czyli podziałowa par jonowych. Jest to specyficzna odmiana chromatografii ciecz-ciecz. Składniki rozdzielane ta metodą to najczęściej związki jonowe lub związki, które z łatwością mogą ulec jonizacji (sulfoniany, aminofenole, sole amoniowe, amonofenole, aminokwasy. Podczas asocjacji tworzą się pary jonowe w środowisku wodnym. Po krótkim czasie od asocjacji pary jonowe muszą przejść do wodno-organicznej fazy, która charakteryzuje się przeciętnymi zdolnościami do solwatacji.

Chromatografia podziałowa LLC (chromatografia ciecz-ciecz) jest bardzo popularną i na szeroką skalę stosowana metodą rozdziału substancji. Dzieje się tak dlatego, że w tej technice możemy stosować rożnego rodzaju fazy stacjonarne. Możemy rozdzielać substancje polarne, jak i substancje pozbawione takich właściwości. Podstawą do rozdziału jest typ i ilość podstawników wchodzących w skład cząsteczki. Masy cząsteczkowe oczywiście także się pomiędzy sobą różnią. Niektóre grupy związków rozdzielają się bardzo dobrze przy zastosowaniu zwykłej chromatografii ciecz- ciecz. Inne preferują chromatografię ciecz- ciecz z odwróconymi fazami. Zwykła chromatografia ciecz-ciecz rozdziela takie substancje jak: barwniki, pestycydy, plastyfikatory, steroidy, glikole, związki aromatyczne, alkaloidy, kompleksy metali, fenole, Chromatografie ciecz-ciecz z odwróconą faza stosujemy do rozdzielania takich substancji jak: związki aromatyczne, alkohole, antybiotyków, alkaloidów, barbituranów, witamin, pestycydów. Chromatografia PIC, czyli par jonowych stosujemy do rozdziału sulfonamidów, amin biogennych, związków z grupami karboksylowymi.

2. Chromatografia adsorpcyjna LSC (chromatografia w układzie ciecz-ciało stałe)

Chromatografia adsorpcyjna LSC po raz pierwszy została wykorzystana w 1906 roku. Zastosowana została do rozdzielenia zielonych barwników wchodzących w skład roślin. Chromatografia adsorpcyjna LSC (chromatografia w układzie ciecz-ciało stałe) rozdział ma miejsce pomiędzy faza ruchomą, która stanowi ciecz, a faza stacjonarną, którą stanowi ciało stałe. Na fazie stacjonarnej ma miejsce ma miejsce proces odwracalnej adsorpcji rozdzielanych substancji. Gdy mamy do czynienia z fazami stacjonarnymi wykazującymi polarność, np. tlenek glinu, żel krzemionkowy, to wówczas stosujemy fazy ruchome nie wykazujące polarności, np. chloroform, heksan). Jeżeli faza stacjonarna nie wykazuje polarności, np. substancje polimeryczne, to mamy do czynienia z faza ruchomą wykazującą polarność, np. metanol, woda. Metoda w której mamy do czynienia z polarną faza ruchoma nazywamy chromatografią adsorpcyjną z odwróconą fazą. Najważniejszym plusem chromatografii adsorpcyjnej LSC (chromatografii w układzie ciecz-ciało stałe) jest jej selektywność. Niestety za pomocą tej metody nie możemy rozdzielić substancji różniących się tylko masą cząsteczkową, ale możemy rozdzielić substancje biorąc pod uwagę rodzaj grup funkcyjnych. Metoda ta jest stosowana do rozdzielania takich substancji jak: steroidy, barwniki, witaminy, aminy, węglowodory, alkohole, tłuszcze, amidy, barbiturany.

3. Chromatografia IEC (chromatografia jonitowa)

Ten rodzaj chromatografii to chromatografia adsorpcyjna, w której fazę stacjonarną tworzy żywica jonowymienna (anionit lub kationit). Składniki rozdzielają się w kolumnie chromatograficznej ze względu na oddziaływania międzycząsteczkowe między centrami wymiany i jonami badanej próbki. Jeżeli jony słabo oddziałują z centrami wymiany, to tylko nieznacznie ulegają retencji, w niewielkim stopniu zatrzymują się na kolumnie. Chromatografia IEC (chromatografia jonitowa) stosowana jest do rozdzielenia związków ulegających jonizacji i związków już zjonizowanych. Substancje, które są niejonowe, możemy rozdzielić, jeżeli wpierw utworzymy kompleksy jonowe. Ten typ chromatografii ma bardzo duże zastosowanie w biochemii. Aminokwasy, białka, kwasy nukleinowe nie wykazują dużej lotności, dlatego też nie mogą być analizowane z zastosowaniem chromatografii gazowej. Doskonale to tego typu związków nadaje się chromatografia IEC (chromatografia jonitowa). W roztworach związki te mogą ulec dysocjacji. W tego typu chromatografii możemy rozdzielać jeszcze takie związki jak: glikozydy, cukry, kwasy karboksylowe, środki znieczulające, puryny, kationy metali, aniony nieorganiczne.

4. Chromatografia GPC (chromatografia żelowa, chromatografia filtracyjna)

Chromatografia GPC po raz pierwszy została użyta w 1959 roku. Wtedy został wprowadzony żel Sephadex - żel dekstranowy. W chromatografia GPC nazywanej także chromatografią żelową lub chromatografią filtracyjną są stosowane następujące fazy stacjonarne:

- faza stacjonarna w postaci aerożelu (żel krzemionkowy lub szkło porowate);

- faza stacjonarna w postaci kserożelu (poliakryloamid, dekstran);

- faza stacjonarna w postaci aerożele-kserożele (polistyren, poliwinylooctan, agarowa).

Składniki przeznaczone do rozdzielenia w chromatografii żelowej rozdzielają się ze względu na wielkość i geometrie cząstek. Współczynnik podziału K równy 1 ma miejscy, gdy mamy do czynienia z małymi cząstkami. Cząsteczki takie z łatwością mogą przedostawać się do porów w fazie stacjonarnej. Większe cząsteczki ze współczynnikiem równym 0 nie są w stanie dostać się do porów ulokowanych w fazie stacjonarnej. Cząsteczki ze współczynnikiem w granicach K równego 0-1 mają średnie wymiary. Największą wadą chromatografii żelowej jest fakt, że ta metoda nie jesteśmy w stanie rozdzielić substancjo o podobnych masach cząsteczkowych. Ten typ chromatografii cieczowej jest wykorzystywany do wstępnego rozdzielania, np. może być użyta do określenia współczynnika rozkładu ciężaru cząsteczkowego polimerów polidyspersyjnych. Jest to główne zastosowanie tego typu chromatografii. Może być także wykorzystana do: analizy białek, silikonów, kwasów nukleinowych, cukrów, peptydów, glikoli.

Przebieg doświadczenia

Głównym zadaniem przeprowadzonego doświadczenia będzie rozdzielenie mieszaniny węglowodorów aromatycznych takich jak: ksylen, toluen, benzen, mezytylen.

Odczynniki:

- metanol cz.d.a.;

- wodny 80% roztwór wodny metanolu;

- 2% roztwór toluenu, benzenu, mezytylenu.

Sprzęt:

- Chromatograf HPLC (wysokosprawny cieczowy) podłączony bezpośrednio z integratorem. Integrator jest w stanie zarejestrować sygnały, które wychodzą z detektora. Sygnały przyjmowane przez detektor określają poszczególne piki. Ich czas retencji, wysokość i pole pików. Integrator ponadto jest w stanie wykonać niezbędne obliczenia odnośnie ilościowego składu badanej próbki. Może także określić poszczególne substancje mieszaniny biorąc pod uwagę chromatogramy wzorców, które są w pamięci integratora.

- kolumna ODS o wymiarach: 25cm długości, 4,6mm średnicy;

- detektor UV 254nm.

Sposób wykonania analizy badanej próbki:

Pobieramy 2ml badanej próbki i przenosimy ilościowo do kolby miarowej na 50ml. Dopełniamy kolbę alkoholem metylowym do kreski. Następnie kolbę dokładnie mieszamy. W en sposób przygotowany roztwór wstrzykujemy przez zawór do kolumny chromatograficznej. Należy przeprowadzić rozdział substancji w mieszaninie stosując szybkość przepływu eluanta 1ml/min. Eluentem w naszym przypadku jest 80% roztwór metanolu. W taki sam sposób postąpić zmieniając tylko prędkość przepływu eluanta na 3ml/min.