DNA opisuje ważne dla funkcjonowania każdej komórki takie związki jak: rRNA który jest składnikiem rybosomów, tRNA który zaangażowany jest w syntezę białek oraz inne.

Zatem w DNA można wyróżnić kilka klas różnych genów, których transkrypcja doprowadza do powstania produktów różnego rodzaju. Trzeba sobie uświadomić, iż DNA w całości nie jest wykorzystany w celu kodowania informacji dotyczącej struktury wspomnianych wyżej związków. Część znaczna deoksyrybonukleinowego kwasu to rejony, nie będące nigdy "przetwarzane", służą jedynie m.in. do przyłączania regulujących procesy powiązane z DNA czynników ( takie jak rekombinacja, replikacja, sama ekspresja oraz szereg pozostałych ). W genomie istnieją także obszary, których rola jak do tego czasu nie została odkryta.

Eukariotyczne DNA można zatem podzielić na następujące klasy:

  1. Geny które kodują białka - stanowią u ssaków one około 2% (zatem bardzo niewiele) całości DNA; wśród nich wyodrębnić można geny:
    • występujące w pojedynczej kopii - przykładem jest gen który koduje owalbuminę (białko główne kurzego jaja ). Godnym zauważenia jest to, iż jedna kopia danego genu jest wystarczająca by zsyntetyzować ogromną ilość białka przez tenże gen kodowanego.
    • powielone:
      • kilkakrotnie - tak jak dla genu który koduje podjednostkę hemoglobiny
      • wielokrotnie - geny histonów, u jeżowca na przykład obecne są w liczbie 300 - 1000, u człowieka z kolei 30 - 40 kopii.
  1. Geny które nie kodują białek ( ich produktem końcowym jest RNA ) - powtórzone wielokrotnie. Pośród nich wyróżnić można geny:
    • tRNA - to transportujący RNA, bierze udział w procesie translacji;
    • rRNA - to różnych rodzajów rybosomalny RNA; część z nich jest zgromadzona w tandemy;
    • snRNA - jądrowy mały RNA który pełni ważną rolę w procesie wycinania intronów;
  1. Pseudogeny - to odcinki DNA, które przypominają geny normalne obecne w genomie określonego organizmu; one nie kodują produktu funkcjonalnego.
  2. Sekwencje powtarzające się, których rola nie jest poznana w większej części przypadków.
  3. Obszary które służą do wiązanie się z czynnikami regulującymi procesy powiązane z DNA - silencery, enhancery i inne.

I ty sposobem przejść można do omówienia ekspresji genetycznej informacji. Ona obejmuje szereg precyzyjnie regulowanych i skomplikowanych etapów.

REPLIKACJA DNA EUKARIOTYCZNYCH ORGANIZMÓW

Replikacja to proces, w którym ma miejsce podwojenie ilości genetycznego materiału w komórkach które mają wejść w mejotyczny lub mitotyczny podział czyli będących w trakcie fazy S komórkowego cyklu. Znaczenie replikacji widoczne jest najwyraźniej, gdy zostaje poruszony temat "losu genetycznej informacji " określonego organizmu w embrionalnym rozwoju. Jest wiadomym, iż wszystkie wielokomórkowe organizmy ( m.in. ludzie, u których ciała posiadają biliony komórek) swój początek wzięły z zygot pojedynczych, w których został zdeponowany genetyczny materiał każdego z rodziców. Podziały kolejne prowadzące do zwiększenia liczby komórek są związane z koniecznością zwiększenia dwukrotnego ilości DNA dotyczącego komórek zarodka rosnącego. Za powielanie zawartej w DNA informacji są odpowiedzialne enzymy nazywane polimerazami DNA, a działanie tych enzymów jest niezwykle precyzyjne. Materiał genetyczny dzięki temu w każdej z komórek jest identyczny w zasadzie, co oznacza iż niesie taką samą informację.

Polimeraza DNA wstawia błędny nukleotyd raz na 1 miliard nukleotydów prawidłowo włączonych. Zważywszy, iż ludzka diploidalna komórka zawiera około 7 miliardów par zasad (jądrowego DNA ), podczas jednej replikacyjnej rundy kilka zaledwie ( do kilkunastu ) nukleotydów wbudowanych jest mylnie. Tak wysoki stopień wierności replikacji jest wynikiem aktywności korekcyjnej polimerazy.

Ze względu na to, iż w całym ożywionym świecie replikacją rządzą identyczne prawa jak w przypadku Procaryota, opisane zostaną poniżej jedynie istotniejsze elementy które dla eukariontów są charakterystyczne.

REPLIKACJA A ORGANIZACJA I WIELKOŚĆ EUKARIOTYCZNEGO GENOMU

Proces zwiększani ilości DNA ma swój początek w miejscach zwanych miejscami inicjacji Miejsc tych w eukariotycznym DNA jest mnóstwo, co wynika z jego długości. Tak na przykład w największym wśród czterech chromosomów występujących u Drosophila, mającym 62 mln. p. z., proces replikacji rozpoczyna się z więcej niż 6 tys. miejsc (nazywanych Ori). Ori u eukariontów występują w międzygenowych strefach, nie są sprecyzowane tak ściśle jak dla Procaryota. To oznacza, iż replikacja danego fragmentu rozpocząć się może w jednym sposród kilku miejsc.

W czasie replikacji ( także innych procesów powiązanych z DNA np. transkrypcji ) jest konieczne rozluźnienie struktury tworzonej chromatyny aby umożliwić oddziaływanie enzymatycznego (replikacyjnego) aparatu z DNA. To rozluźnienie dotyczy poszczególnych odcinków, przez które przechodzą w określonym momencie replikacyjne widełki, a nie całości chromosomu. Eliminację nukleosomowych struktur, co pociąga za sobą wypętlenie fragmentu który ma podlegać replikacji, umożliwiają białka zwane białkami jądrowych struktur. Demontaż nukleosomowego rdzenia zainicjowany jest prawdopodobnie usunięciem albo dysocjacją dimeru H2A : H2B. Do wyeksponowanego tak nagiego DNA posiadają dostęp replikacyjne białka. Po przekroczeniu danego fragmentu replikacyjnych widełek czyli po dosyntetyzowaniu nici DNA nowych ( tzw. potomnych ) dochodzi do odbudowania nukleosomowej struktury. Interesujący jest to, iż histony "stare" ( tj. te które pochodzą z demontażu ) są wykorzystywane przez cząsteczkę DNA, zawierającą wiodącą nić

Nić opóźniona - w skład której wchodzą fragmenty Okazaki - wychwytuje de novo syntetyzowane histony specjalnie na potrzeby replikacji czyli podczas trwającej fazy S. Podwajaniu ilości kwasu DNA bowiem towarzyszy dwukrotnie wzrost zapotrzebowania na histony, stąd występuje konieczność syntetyzowania porcji brakującej zasadowych białek.

EUCARYOTA MAJĄ RÓŻNE CZTERY REPLIKAZY

Wśród pięciu typów polimeraz DNA obecnych w eukariotycznych komórkach, cztery to enzymy zaangażowane w przebieg procesu replikacji. Z nich trzy oddziałują z jądrowym DNA, czwarta natomiast pełni funkcję replikazy na obszarze chloroplastów i mitochondriów.

Aktywność polimeraz jest regulowana przez wspomagające białka.

Replikazy które działają na obszarze jądra

Zdolność polimerazy syntezy starterów ( niedługich fragmentów RNA, nie DNA!) jest wynikiem współdziałania jej z primazami - czyli enzymami odpowiedzialnymi bezpośrednio za wytwarzanie odcinków RNA oraz występującymi w kompleksie z nią. Polimeraza dobudowuje jedynie do starterów fragmenty krótkie DNA, będące eliminowane w kolejnych etapach replikacji wraz z fragmentami RNA ( proces wycinania starterów). Powstałe tym sposobem luki najprawdopodobniej wypełnia polimeraza nie przynależna do replikaz.

EUKARIOTYCZNE CHROMOSOMY ZAWIERAJĄ TELOMERY

Ponieważ eukariotyczne chromosomy są liniowymi cząsteczkami, są narażone na niebezpieczeństwo skracania stopniowego - w kolejnych replikacyjnych rundach - które mogłoby być dla komórki brzemienne w skutkach. To niebezpieczeństwo jest związane z brakiem możliwości do tego by wypełnić lukę po wycięciu startera skrajnego obecnego na 5' końcu opóźnionej nici.

Zabudowanie tejże luki nie jest możliwe, gdyż polimeraza funkcjonująca w kierunku 5' - 3' wymaga "zaczepienia" na końcu 5' ( który w tymże przypadku jest nieobecny), nie istnieje poza tym enzym, który może polimeryzować zgodnie z kierunkiem 3' - 5'. Rozwiązaniem zagrożenia tego typu jest obecność telomerów na końcach każdego z chromosomów. Są nimi długie odcinki 6- nukleotydowej sekwencji setki razy powtarzającej się, która ma u człowieka postać AGGGTT. Te odcinki są dobudowywane przez telomerazę. To enzym posiadający w swej budowie odcinek RNA komplementarny względem telomerowej sekwencji tj. matrycę służącą do procesu syntezy telomerów.

Podsumowanie:

  1. Replikacja jest procesem podwajania ilości kwasu DNA przed wystąpieniem komórkowego podziału.
  2. Podczas replikacji - dzięki obecności mechanizmów które kontrolują poprawność włączania następujących po sobie nukleotydów - zawarta w DNA macierzystym informacja skopiowana zostaje z bardzo dużą dokładnością.
  3. Schemat replikacji ogólny jest identyczny dla Eucaryota i Procaryota, a obecne różnice przede wszystkim wynikają ze sposobu i wielkości upakowania genomu każdej z grup organizmów.

TRANSKRYPCJA

Transkrypcja jest procesem, w którym mieszcząca się w DNA informacja - zapisana w postaci sekwencji deoksyrybonukleotydów - zostaje przepisana na język nukleotydów w cząsteczce pre-mRNA w czasie reakcji która katalizowana jest przez enzym nazywany polimerazą II RNA.

Każdy etap ekspresji jest niezwykle złożony. Sam proces transkrypcji nie stanowi wyjątku, bowiem dzieli się ona na trzy zdarzenia po sobie następujące:

  • inicjację transkrypcji,
  • elongację (wydłużanie) łańcucha pre-mRNA,
  • terminację.

Inicjacja transkrypcji

Zanim omówione zostanie tytułowe zagadnienia, zapoznać się należy z budową eukariotycznego genu, będącego kodującą białko jednostką. Ujęcie w taki sposób znaczenia genu okazać się może bardzo mylące, ponieważ sugeruje ono, iż całość genu ( od pierwszego aż do nukleotydu ostatniego) niesie informację dotyczącą struktury białka.

Jednak w rzeczywistości takie wskazówki są zawarte jedynie w odcinkach genu nazywanych egzonami. W ramach części genu, która przepisana zostanie na mRNA poza egzonami obecne są także fragmenty najczęściej będące wtrętami nie mającymi żadnego znaczenia. Określane są mianem intronów. Podczas transkrypcji te fragmenty "zbędne" są tak samo przepisywane jak egzony na pierwotne mRNA ( pre-mRNA ), przed translacją są one także eliminowane.

Gen poza obszarem transkrybowanym posiada także promotor oraz terminator na odpowiednio swym końcu 5' oraz 3', a jedno oraz drugie pojmować należy raczej jako funkcjonalne obszary a nie tylko strukturalne.

Inicjacja transkrypcji jest tym momentem, w którym ma miejsce precyzyjna najbardziej kontrola ekspresji genów. To, czy określony gen w określonej komórce będzie w danym czasie wyrażony, czyli czy zsyntetyzowane zostanie określone białko, jest uzależnione w przeważającej mierze od faktu zapoczątkowania transkrypcji. Zdarza się oczywiście, iż transkrypcja zachodzi, lecz na kolejnych etapach ekspresja wygaszona zostaje, czego rezultatem jest brak wytwarzania białka. Generalnie jednakże inicjacja transkrypcji stanowi główny kontrolny punkt ekspresji. Inicjację określana jest jako zdarzenia mające miejsce na terenie promotora, jak i również położonych daleko rejonów nazywanych enhancerami (czyli wzmacniaczami), umożliwiającymi podjęcie działania polimerazie II RNA. U eukariontów polimeraza II RNA do zapoczątkowania odpowiednich reakcji wymaga obecności określonych białek, określanych mianem transkrypcyjnych czynników tzw. TF-ów ( z ang. transcription factors). Te białka w porządku określonym ulega związaniu z DNA w obszarze promotora, silencerów bądź enhancerów.

To właśnie brak lub ich obecność w określonej komórce (lub tkance) w mierze znacznej decyduje o rozpoczęciu albo też braku transkrypcji określonego genu. Poza białkami na transkrypcję także mogą wpływać hormony.

Trzeba tutaj jednak zaznaczyć, iż jakkolwiek TF-y stanowią istotny czynnik w procesach regulacji ekspresji genetycznej informacji, tak czynnikiem najważniejszym jest struktura jaką posiada chromatyna. Wiadomym jest , iż by transkrypcja określonego genu zaszła do niego musi mieć dostęp " enzymatyczny aparat ". Jeśli dostęp do gen jest łatwy i komórka posiada odpowiednie TF-y, transkrypcja zachodzi. Jeśli z kolei gen przed polimerazą jest "ukryty" obecność zestawu optymalnego transkrypcyjnych czynników na nic się nie zda. Łatwa dostępność genu bądź jej brak jest uzależniona od struktury chromatyny w określonym obszarze, w którym on występuje. Im jest silniejsza kondensacja jej tym mniejsza występuje możliwość przyłączenia się enzymu. Jak się okazało w różnego rodzaju tkankach zróżnicowane odcinki DNA są skondensowane mocno ( zheterochromatynizowane ). Zatem, jeśli wiadomo, iż gen konkretny w określonej tkance nie podlega transkrypcji można stwierdzić z wysokim prawdopodobieństwem, iż rejon w którym lokuje się jest niedostępny dla transkrypcyjnego aparatu.

Rejony DNA mające regulacyjne funkcje

Sterowanie transkrypcją - poprzez związanie hormonalnych czy białkowych czynników - może zachodzić z miejsc różnych na DNA. Te miejsca leżeć mogą w ramach genów ( promotory ), albo również w odległości liczącej kilka tysięcy nukleotydów (silencery, enhancery).

Promotory

Promotorowy obszar genu zlokalizowany jest na jego końcu 5', posiada kilka ważnych rejonów, które rozpoznawane są przez polimerazę II RNA (rejon najbliżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji) a także transkrypcyjne czynniki. Pośród wspomnianych już rejonów najbardziej powszechnym i najistotniejszym jest odcinek zwany kasetą TATA ( tzw. TATA-box ). To sekwencja 7-nukleotydowa zlokalizowana w odległości około 25 p.z. od miejsca gdzie startuje transkrypcja, która prezentuje się w pełni następująco: 5'- TATAAAA -3'. Obecność kasety TATA, chociaż niezbędna dla niemal każdego genu; nie stanowi wystarczającego czynnika, by z promotora rozpoczęła się transkrypcja. Do aktywności pełnej promotora są niezbędne inne sekwencje obecne w rejonie zaczynającym się od -110 do -40 (ta odległość podana jest w ilości nukleotydów na lewo począwszy od miejsca rozpoczęcia transkrypcji). TATA-box stanowi tzw. rdzeniową część promotora. Promotory genów ponadto zawierają inne sekwencje, nie aż tak powszechne, odgrywające ważną rolę w różnych tkankach wyposażonych w białka które rozpoznają owe sekwencje.

Silencery i enhancery

Enhancery są sekwencjami wzmacniającymi aktywność promotorów. Mogą być położone w znacznej nawet odległości od danego genu, zachowują regulacyjną zdolność również po zmianie eksperymentalnej orientacji o 180° względem danego genu. Czynniki transkrypcyjne wiążą się do enhancerów i określane są jako aktywatory, oddziaływujące z polimerazą II RNA oraz promotorowymi TF-ami. Możliwość istnienia oddziaływań enhancer : promotor pomimo odległości między nimi równej czasami kilka tysięcy par zasad zachodzi dzięki wysokiej elastyczności struktury DNA. Objawem elastyczności jest zdolność DNA do wyginania się dowolnego.

Interakcje promotor : enhancer

Enhancery - w rozumieniu sekwencji - są obecne we wszystkich komórkach (DNA jest identyczny w każdej komórce organizmu), z kolei jedynie w części wykazują wzmacniającą aktywność. Fakt ten jest znaczący w procesie regulacji ekspresji genetycznej informacji, a on wynika z różnic obecnych w składzie komórkowych białek poszczególnych tkanek. Dlatego istnieją tkankowo -specyficzne enhancery wzmagające transkrypcję jedynie tam, gdzie są obecne białka ulegające związaniu na ich obszarze. Enhancery posiadają również znaczenie istotne w regulacji procesu transkrypcji poprzez steroidowe hormony.

Silencery - ( z ang. silence = cisza ) służące do tego by wyciszyć aktywność promotora sekwencje; podobnie jak w przypadku enhancerów w zróżnicowanym stopniu mogą być oddalone w każdym kierunku od genu, a również występować w wnętrzu jego struktury.

Ciekawą sytuację zaobserwować można przy regulacji transkrypcji genów kodujących immunoglobuliny ( białek syntetyzowanych tylko w limfocytach typu B ). W przypadku tym silencer jest wbudowany w ramach enhancera, a znaczenie jego uwidocznione jest w komórkach innego typu niż limfocyty B. Stanowi to zabezpieczenie swoiste przed ekspresją określonych genów immunoglobulin powiązane z inaktywacją danego enhancera.

Związki które sterują transkrypcją

Regulacja każdego z procesów odbywać się może w dwojaki sposób: negatywny bądź pozytywny.

Ze względu na to iż w przypadku eukariotycznej transkrypcji poznano lepiej pozytywną regulację najwięcej uwagi poświęcone zostanie aktywatorom, - związkom które umożliwiają polimerazie II RNA start syntezy nici pre-mRNA .

A - Transkrypcyjne czynniki wiążące się ze strukturą promotora.

Polimeraza II RNA eukariotyczna w samej sobie nie ma zdolności do tego by przyłączyć się do odcinka DNA, co idzie za tym do rozpoczęcia procesu transkrypcji. Nim enzym związany zostanie w obszarze startu transkrypcji, przyłączają się do promotora kolejno białka należące do grupy o nazwie TFII ( II stąd, iż współpracują one z II polimerazą ). Kolejność z jaką przyłączają się TF-y i polimeraza do promotora ściśle jest określona.

Tworzenie preinicjacyjnego kompleksu

Jako pierwszy wiąże się do DNA TFIID. Stanowi to kompleks, którego elementami są TBP a także czynniki towarzyszące TBP czyli tzw. TAF (ang. TBP associated factors). TBP jest białkiem wchodzącym z DNA w interakcję bezpośrednią w ramach TATA box. Posiada ona postać swego rodzaju siodła które nasadza się na daną nić nukleinowego kwasu w sposób taki, iż jego fragmenty krańcowe wciskają się pomiędzy pary zasad DNA. Wnikanie między zasady komplementarnych nici wywołuje pierwotne (lekkie) rozplecenie helisy, które jest konieczne w takich procesach jak transkrypcja, czy replikacja.

Następnie TFIIB oraz polimeraza II RNA (w kompleksie tworzonym z TFIIF) przyłącza się do struktury promotora. TFIIF nie ma kontaktu z DNA tak jak TFIIE który przyłącza się do tworzonego białkowego kompleksu jako ostatni.

Czynniki tworzące łącznie z II polimerazą RNA inicjacyjny kompleks.

Czynniki i ich funkcje:

  • TFIID - TBP:
    • umożliwianie TFIIB do przyłączenia się do struktury DNA
    • regulacyjne (represja, aktywacja)
    • przyłączanie się do struktury TATA box (przy rozluźnieniu helisy DNA)
  • TFIIB - umożliwianie połączenia kompleksu polimerazy oraz TFIIF ze strukturą DNA
  • TFIIF - kierowanie do promotora polimerazy II RNA
  • TFIIE - stymulacja aktywności czynnika TFIIH
  • TFIIH:
  • dostarczanie energii która niezbędna jest do przeprowadzenia reakcji (proces hydrolizy ATP)
  • fosforylacja polimerazy (aktywująca modyfikacja enzym )
  • rozplatanie helisy DNA (poprzez aktywność helikazy )

Kompleks omówiony powyżej nazywany jest podstawowym transkrypcyjnym aparatem i pomimo tego, że zdolny jest do przeprowadzenia procesu transkrypcji wykonuje to w niewystarczającym do ekspresji wyraźnej genu i znikomym stopniu. Do promotora (poza wymienionymi TF-ami ) przyłączają się także białka w tym m.in. wcześniej wspomniane ssacze NF1, Sp1 i szereg innych.

Przykładem tkankowo - specyficznych białek są tzw. OTF2B i OTF2A, które występujące tylko w limfocytach typu B - łącząc się z promotorem - dają możliwość ekspresji genów immunoglobulin.

B- Czynniki które wiążą się z różnymi sekwencjami poza promotorem

Dla transkrypcji, efektem której byłaby synteza intensywna RNA ( czyli warunek wyrażenia się genu ) jest niezbędna obecność związków które wzmagają podstawową transkrypcję. To są aktywatory transkrypcji które łączą się w enhancerowych rejonach z DNA.

Kierunki oddziaływań dla aktywatorów transkrypcji

Aktywatory mogą bezpośrednio wpływać na białka podstawowego aparatu, lub też z pośredniczeniem koaktywatorów. Aktywujące związki mogą posiadać różny charakter: steroidowy lub białkowy (w części przeważającej).

Białkowe czynniki obecne stale w określonej tkance są charakterystyczne dla niej oraz swe funkcje w połączeniu ze strukturą enhancera spełniać mogą jedynie w niej.

Steroidowe czynniki, konkretnie hormony w tym takie jak glukokortykoidy występują jako odpowiedź na środowiskowe bodźce i transportowane są z miejsc ich syntezy do docelowych komórek. Hormon, docierający do docelowej komórki ulega związaniu z receptorem ( nie każda komórka ma receptor na hormony przez organizm produkowane) a powstały tak układ hormon : receptor ulega przyłączeniu do enhancera tym sposobem regulując transkrypcję.

Aktywowanie transkrypcji poprzez układ hormon : receptor

Podsumowanie:

  1. Inicjacja transkrypcji to moment precyzyjnej najbardziej kontroli ekspresji danego genu.
  2. Transkrypcja zachodzić może na zróżnicowanych poziomach:
    • podstawowym (niskim),
    • aktywowanym (czyli intensywnym) co uzależnione jest od składu transkrypcyjnych czynników w określonej tkance.
  1. Regulacja transkrypcji jest zależna do czynników:
  • wewnętrznych (obecność kompletu różnych TF-ów, struktura chromatyny na obszarze występowania danego genu);
  • zewnętrznych - sprowokowana bodźcami pochodzącymi ze środowiska odpowiedź np. hormonalna.

Wytwarzanie nici pre-mRNA.

Po spełnieniu każdego z warunków wymaganych do zapoczątkowania reakcji poprzez polimerazę II RNA, ma miejsce synteza nici pre-mRNA (prekursora mRNA) zachowując kierunek od 5' do 3' końca. Jedna cząsteczka enzymu katalizuje transkrypcję pojedynczego fragmentu.

Budowa II polimerazy RNA

Polimerazy II RNA u eukariotów zbudowane są z 8 - 12 podjednostek ( z różnych polipeptydów ), zatem są wysoce złożonymi enzymami. Ich wspólną cechą jest występowanie podjednostek RPB1, 2, 5, 6, 8, a z nich dwie pierwsze są białkami dużymi o cząsteczkowych masach odpowiednio 220 oraz 140 kDa. Na C-końcu podjednostki RPB 1 (karboksylowym końcu białka) występuje w zmiennej ( zależnej od organizmu ) ilości powtórzeń 7-aminokwasowa sekwencja, która jest niezbędna do tego enzym działał. Do tego czasu nie została określona funkcja poszczególnych podjednostek eukariotycznego enzymu w przeciwieństwie prokariotycznego enzymu, w rola wszystkich podjednostek została zdefiniowana.

Polimeraza II RNA jest zlokalizowana w nukleoplazmie, przeprowadza tam poza syntezą mRNA także syntezę snRNA ( z ang. small nuclear RNA ) czyli cząsteczek, o więcej będzie można dowiedzieć się przy omawianiu splicingu.

Jak funkcjonuje polimeraza II RNA?

zadaniem polimerazy II RNA jak wiadomo jest przepisywanie zawartej w danym genie ( DNA ) informacji na język RNA. Ta informacja ( dotycząca struktury białkowych cząsteczek ) jest zapisana jedynie w pojedynczej nici DNA - tzw. kodującej nici. Druga komplementarna nić nie jest nośnikiem informacji o jakimś białku, stanowi jedynie matrycę dla cząsteczek polimerazy, syntetyzującej pre-mRNA w oparciu o zasadę komplementarności. Ta zasada polega na tym iż wbudowywany jest do nici powstającej RNA informacyjnego adeninowego nukleotydu (A) jeżeli w miejscu odczytywanym na matrycy jest obecny tyminowy nukleotyd (T), guaninowego (G) jeżeli na matrycy znajduje się cytozynowy (C) itd.

Nukleotyd znajdujący się na matrycy Nukleotyd który włączany jest do pre-mRNA

A U

T A

G C

C G

Dlatego transkrypt komplementarny jest do matrycowej nici oraz homologiczny z kodującą nicią.

Należy jednakże pamiętać, iż jakkolwiek homologami w pre-mRNA dla A, G i C są rybonukleotydy które niosą identyczne azotowe zasady, to homologiem dla T jest zawierający uracyl (U) rybonukleotyd, nie tyminę.

Porównanie sekwencji w pre-mRNA z sekwencjami występującymi w niciach matrycowej i kodującej genu.

Enzym który syntetyzuje pre-mRNA przesuwają się po DNA jednocześnie dobiera rybonukleotydy odpowiednie oraz przyłącza kolejno je zgodnie z kierunkiem 5' - 3' (czyli do grupy wolnej 3'OH pierwszego z nukleotydów zostaje przyłączona 5' fosforanowa grupa nukleotydu kolejnego ). Ten kierunek obowiązuje we wszystkich reakcjach polimeryzacji nukleinowych kwasów, jest wynikiem mechanizmu wytwarzania wiązań pomiędzy nukleotydami ze sobą sąsiadującymi - fosfodiestrowych wiązań.

Polimeraza RNA to enzym wprowadzający więcej pomyłek w porównaniu z polimerazą DNA gdyż nie wykazuje korekcyjnych właściwości, dlatego przepisanie informacji zawartej w DNA na informację w RNA nie okazuje się wierne w takim stopniu jak z cząsteczki DNA na inny DNA podczas replikacji. Nieobecność korekcyjnych systemów w procesie transkrypcji nie jest powiązane z poważnymi konsekwencjami dla komórki, ponieważ cząsteczka mRNA nieprawidłowa jest jedną pośród licznych prawidłowych cząsteczek.

Synteza danego łańcucha pre-mRNA rozpoczyna się zazwyczaj od połączenia przez enzym guaninowego albo adeninowego nukleotydu, do których są kolejne przyłączane ,,cegiełki''.

Dla eukariontów bardzo charakterystycznym procesem jest występowanie w transkrypcie pierwotnym struktury czapeczki ( z ang. cap ) która wpływa na zwiększenie stabilności pre-mRNA. Ten proces zachodzi z transkrypcją równolegle, stanowi jedną z faz obróbki pre-mRNA (pozostałe rodzaje obróbki mają miejsce po zsyntetyzowaniu całości nici mRNA pierwotnego). Zaopatrzony w czapeczkę transkrypt jest wrażliwy mniej na działanie fosfataz i nukleaz tj. enzymów które odpowiedzialne są za degradację nukleinowego kwasu. Rozpoznanie czapeczki jest również ważne w czasie inicjacji translacji.

Mechanizm wytwarzania czapeczki zawiera w sobie 3 etapy zasadnicze:

  1. modyfikację trifosforanu z końca 5' poprzez uwolnienie pojedynczej fosforanowej reszty drogą hydrolizy;
  2. przyłączenie GTP 5'-5'-trifosforanowym wiązaniem;
  3. metylacja guaniny zachodząca w pozycji N7 czyli przyłączenie metylowej reszty (-CH3 ) do 7-go atomu azotu w danej cząsteczce guaniny.

Metylacja cukrowcowych reszt (rybozy) nukleotydów kolejnych wygenerować może kolejne czapeczki.

Proces wydłużania łańcucha pre-mRNA ulega zakończeniu w miejscach terminacji, poznanych dosyć dokładnie u Procaryota, jednak nadal mało scharakteryzowane u wyższych organizmów.

Podsumowanie:

  1. Transkrypcja jest rządzona przez zasadę komplementarności.
  2. Proces wydłużania nici pre-mRNA przechodzi w kierunku 5'- 3'.
  3. Z elongacją transkryptu pierwotnego równolegle ma miejsce modyfikacja jego końca 5' tj. wytworzenie struktury czapeczki.
  4. Produktem katalizowanej poprzez polimerazę II RNA reakcji jest pre-mRNA czyli cząsteczka posiadająca introny.

OBRÓBKA PRE-mRNA

Po osiągnięciu transkryptu pierwotnego, który by stać się w syntezie białkowej cząsteczki matrycą, musi ulec modyfikacjom zasadniczym. One polegają na wycięciu sekwencji intronów i ( co stanowi charakterystyczną cechę dla większej części pre-mRNA ) dodaniu długiego fragmentu zwanego poli A na końcu3'.

Poliadenylacja

Większość znakomita produktów reakcji które katalizowane są przez polimerazę II RNA posiada na swym końcu 3' tzw. ogon poli A, czyli ciąg liczący 100 - 250 nukleotydów adeninowych ze sobą połączonych. Nie oznacza to jednak, iż w większej części genów występuje obszar obfitujący w pary AT. Odcinek poli A nie stanowi efekt transkrypcji a modyfikacji posttranskrypcyjnej, w której bierze udział enzym nazywany polimerazą poli A.

Enzym ten dodaje na końcu 3' transkryptu pierwotnego kolejne adeninowe nukleotydy dopiero po tym jak zadziała specyficzna nukleaza czyli enzym tnący nukleinowy kwas w ramach jego cząsteczki. Odcinek poli A nie jest jak się okazuje dołączany do nukleotydu ostatniego wbudowanego w drodze transkrypcji, lecz do tego właśnie, który okazał się ostatnim nukleotydem po rozcięciu danej nici pre-mRNA. Atakowane poprzez nukleazę miejsce nie jest miejscem dowolnym, jest wyznaczone przez sekwencję: AAUAAA zlokalizowanej w zróżnicowanej odległości od miejsca przeznaczonego działania enzymu.

Mechanizm przeprowadzania poliadenylacji pre-mRNA.

U ssaków na przykład cięcie występuje w odległości równej 10 - 30 nukleotydów za odcinkiem o sekwencji AAUAAA.

Istnieją geny posiadające więcej niż tylko jeden sygnał poliadenylacji ( czyli wspomnianą sekwencję ). To oznacza, iż na matrycy tych powstanie parę transkryptów pierwotnych które różnią się długością, a zatem i kilka mRNA różnego rodzaju. Przykładem poliadenylacji alternatywnej może być pewna modyfikacja transkryptu pierwotnego genu szczurzego kodującego kalcytoninę.

Ten gen posiada miejsca poliadenylacji w ilości 2, pierwsze z nich jest preferowane w komórkach występujących w tarczycy, drugie kolei - w mózgu.

Podobnie jak czapeczka ogon poli A chroni cząsteczkę transkryptu pierwotnego przed działaniem różnych nukleaz. Ponadto może mieć znaczenie w procesie translacji, bowiem okazuje się, iż transkrypt bez ogona poli A stanowi matrycę mniej wydajną przy syntezie różnych białek.

Wycinanie intronów

Nim powstanie dojrzały, ostateczny mRNA mogący podlegać translacji, pre-mRNA zostać musi pozbawiony intronów. Wycinanie tych "wtrętów" niekodujących nazywany jest splicingiem. Proces ten wykorzystuje jeden aparat enzymatyczny wspólny dla pozbywania się wszystkich intronów.

To oznacza, iż introny muszą posiadać pewne wspólne elementy które rozpoznawane są przez wspomniany splicingowy aparat. Z porównywania różnych sekwencji intronów wynika, iż łączą je podobieństwa następujące:

  • na końcu 5' posiadają zawsze kolejno: guaninową oraz uracylową resztę (5'- GU)
  • na ich końcu 3' występuje guaninowa reszta poprzedzona adeninową resztą (AG - 3')
  • zawierają wewnątrz tzw. miejsce rozgałęzienia; kluczową rolę dla splicingu w tym miejscu odgrywa adeninowy nukleotyd.

Splicingowe sygnały

Mechanizm splicingu

Proces wycinania intronów, jak wszystkie procesy przeprowadzane przez żywy organizm, jest skomplikowane. W nim można wyróżnić kilka etapów:

  1. Rozcięcie struktury pre-mRNA w splicingowym miejscu 5' (czyli na końcu 5' intronu). Wskutek tej reakcji ma miejsce uwolnienie fosforanowego końca 5' egzonu 1.
  2. Atak (z miejsca lokalizacji rozgałęzienia) grupy 2'-OH adeninowego nukleotydu na 5' fosforanową grupę guaninowego nukleotydu intronu. Wiadomym jest iż wiązania pomiędzy nukleotydami kolejnymi to fosfodiestrowe wiązania tworzone pomiędzy tzw. 5' fosforanową grupą a hydroksylową grupą ( -OH) rybozy. Do tego wiązania zazwyczaj angażowana jest grupa 3'-OH, jednak pozostałe hydroksylowe reszty m.in. 2' mają zdolność do wchodzenia w interakcje z fosforanową resztą. I tak adeninowy nukleotyd ( z miejsca lokalizacji rozgałęzienia ) posiadając grupę 3'-OH która wykorzystana jest w "normalnym" fosfodiestrowym wiązaniu w interakcji z fosforanową resztą 5' intronu określonego angażuje 2'-OH grupę. Tutaj tworzy się wiązanie 2'-5' fosfodiestrowe.
  3. Atak grupy 3'-OH uwolnionej egzonu 1 na grupę fosforanową 5' egzonu 2 wraz z uwolnieniem tego intronu posiadającego postać lassa.

Spliceosom

Reakcje opisane powyżej samoistnie nie zachodzą. Katalizowane są one poprzez kompleks cząstek kolejno przyłączających się tworzących spliceosom. Aparat splicingowy składa się z 5 rodzajów snRNP (tj. białka + snRNA): U1, U2, U4, U5 oraz U6, a każdy z nich pełni istotną, odrębną funkcję:

  • U1- ulega połączeniu ze splicingowym miejscem 3' i 5' w oparciu o zasadę komplementarności, bowiem zawiera on w swojej komponencie rybonukleinowej sekwencję komplementarną względem styków egzon - intron ;
  • U2 - umożliwia wiązanie miejsca rozgałęzienia;
  • U6 - obecne w kompleksie w połączeniu z U5 i U4, katalizuje splicing.

Produkt splicingu to dojrzały mRNA który niesie tylko istotne informacje które dotyczą budowy białka ( oprócz fragmentów skrajnych, dla których zadaniem głównym jest stabilizacja danego transkryptu ). Jednak okazuje się, iż na matrycy pojedynczego genu powstać może kilka mRNA różnego rodzaju, co powodowane jest poza poliadenylacją alternatywną tzw. splicingiem alternatywnym. Prowadza się on do łączenia różnych egzonów ze sobą tzn. niekoniecznie każdego z występujących w cząsteczce pre-mRNA.

3'NT i 5'NT - obszary które nie ulegają procesowi translacji.

Nie jest wiadomym dokładnie jeszcze, dlaczego w zróżnicowanych tkankach są wybierane odmienne wzory składania egzonów. Możliwe jest iż maszyneria która obsługuje wycinanie intronów z cząsteczek nie jest taka sama w każdym rodzaju komórek tzn. obecne są pewne subtelne, lecz znaczące różnice pomiędzy spliceosomami danych tkanek. Jest także możliwe, iż podstawowy splicingowy aparat jest uniwersalny i różne tkanki posiadają charakterystyczne dla siebie czynniki (RN-owe lub białkowe) które łączą się z cząsteczką pre-mRNA, co w konsekwencji może być ułatwieniem albo utrudnieniem funkcjonowania spliceosomów w miejscach różnego w obrębie transkryptu pierwotnego.

Podsumowanie:

  1. Pre-mRNA nim stanie się matrycą pełnowartościową do syntezy cząsteczki białka przejść musi przez proces jakim jest dojrzewanie.
  2. Dojrzewanie ma w sobie 3 modyfikacje zasadnicze:
    • capping ( czyli dodawanie czapeczki )
    • poliadenylację która podnosi stabilność transkryptu;
    • splicing w nim są eliminowane niekodujące wewnętrzne rejony RNA informacyjnego.
  1. Alternatywna poliadenylacja i splicing generować mogą różne produkty ( mRNA ) które wykrywane są w tkankach różnych, co oznacza, iż jeden gen kodować może więcej niż pojedyncze białko.
  2. Dojrzewanie pre-mRNA stanowi warunek eksportu z jądra transkryptu.
  3. Dojrzały mRNA ulega związaniu z białkami wykazującymi wpływ na translację, stabilność i transport tej cząsteczki.

TRANSLACJA

Translacja - jest procesem, w którym ma miejsce odczyt genetycznej informacji z mRNA oraz synteza białka. W nim biorą udział poza matrycą ( mRNA ) oraz aminokwasami również cząsteczki tRNA ( które dostarczają aminokwasy ), rybosomy i szereg wspomagających czynników.

mRNA do cytoplazmy przetransportowany ulec może translacji, albo także zostać zdegradowany szybko, jeżeli białko zakodowane przez to mRNA w komórce występuje w ilości dostatecznej. Tak np. mRNA dla białek histonowych jest niezwykle stabilne podczas fazy S komórkowego cyklu, czyli w momencie, gdy obserwuje się zapotrzebowanie najwyższe na histony. W S fazie zatem następuje translacja histonowego mRNA. W pozostałych fazach komórkowego cyklu stabilność tychże transkryptów jest niższa w przybliżeniu 5-krotnie, co oznacza, iż one ulegają degradacji.

Wnioskiem z tego jest to, iż synteza białka odbywa się zależnie od potrzeb danej komórki, regulacja zatem ekspresji genetycznej informacji odbywa się również na etapie który poprzedza translację.

Rybosomy

Rybosomy stanowią organella komórkowe będące miejscem syntezy białka. Poza cytoplazmą występują one również w chloroplastach i mitochondriach. W cytoplazmie rybosomy występować mogą w wolnej formie albo związanej z endoplazmatycznym retikulum. Pierwsze z wymienionych biorą udział w translacji cytosolowych białek, drugie z kolei białek które eksportowane są do wewnętrznej części retikulum a także na zewnątrz danej komórki. Każdy z rodzajów rybosomów jest zbudowane z dwojakiego rodzaju podjednostek:

  • małej, jej stała sedymentacji równe jest 40S;
  • dużej mająca współczynnik sedymentacji wynoszący 60S.

Zbudowane są z RNA rybosomalnego ( 18S rRNA podjednostki małej; 5, 5.8, 26, 28S rRNA podjednostki dużej) i kilkudziesięciu białek, o składzie różnym w każdej z "części" rybosomu. Rybosom posiada trzy ważne miejsca zwane A ( aminokwasowe ), E ( exit - wychodzi tędy tRNA "zużyty" ), P ( peptydowe ), omówionych w częściach dalszych tego rozdziału.

Przebieg translacji

Proces translacji mRNA przebiega w kierunku 5' - 3', dlatego pierwszy aminokwas polipeptydu syntetyzowanego jest zakodowany poprzez kodon który leży bliżej końca 5' transkryptu. Natomiast wbudowanymi najwcześniej aminokwasami tworzonego białka są białak stanowiące jego część N - terminalną. Jest to wynikiem mechanizmu tworzenia peptydowych wiązań pomiędzy aminokwasami sąsiadującymi Translację można podzielić na następujące zasadnicze etapy:

  1. inicjację,
  2. elongację,
  3. terminację.

Inicjacja

Pierwszy etap syntezy białka to przyłączenie cząsteczki mRNA do podjednostki mniejszej rybosomu ( 40S ) przy obecności tRNA inicjatorowego a także szeregu inicjujących czynników.

Pierwszy kodon u eukariontów ulegający translacji to kodon AUG ( zwany kodonem start ), koduje metioninę.

Ze względu na to iż w mRNA takich trójek może być mnóstwo, miejsce początku procesu translacji jest wyznaczone przez kodon, który jest położony najbliżej końca 5'. W odszukaniu pierwszego czyli inicjacyjnego metioninowego kodonu udział biorą czynniki nazywane eIF3 oraz eIF4; pierwszy z nich przyłącza do czapeczki białkowy kompleks ( tzw. CBP ) i odszukuje AUG, drugi natomiast - eIF4 dostarczyć może energię do poszukiwań. Jednak zanim rybosom wraz z białkiem związanym eIF3 zacznie przesuwać się po mRNA szukając AUG, związany zostaje do podjednostki oznaczonej jako 40S inicjatorowy aminoacylo tRNA czyli tRNA który niesie cząsteczkę aminokwasu - w tym przypadku metioniny. Gdy krocząca po mRNA podjednostka 40S wraz ze związanym Met-tRNA dotrze do kodonu "start" ma miejsce przyłączenie podjednostki większej rybosomu ( 60S ).

Przykłady eukariotycznych inicjacyjnych czynników:

Nazwa czynnika oraz jego funkcje:

  • eIF2 - przyłączenie aminoacylo tRNA inicjacyjnego do podjednostki o oznaczeniu 40S
  • eIF3:
    • Udział w procesie przyłączania białek CBP do końca 5' mRNA
    • Odszukiwanie inicjacyjnego kodonu
    • Uniemożliwianie asocjacji rybosomowych podjednostek przy nieobecności innych inicjacyjnych czynników
  • eIF4 - Dostarczanie energii która niezbędna jest w działaniu eIF3 pochodzącej z hydrolizy cząsteczek ATP
  • eIF5 - Indukcja uwolnienia eIF3 i eIF2 kosztem energii pochodzącej z hydrolizy cząsteczek GTP ( powiązanego z eIF2 )

Inicjacja translacji jest kolejnym kontrolnym punktem w ekspresji genetycznej informacji. Regulacja ekspresji odbywa się na tym właśnie etapie za pośrednictwem cząsteczek czynnika eIF2, zdolnego do inicjowania procesu translacji jedynie wtedy, gdy ma przyłączoną cząsteczkę GTP. Nieaktywny eIF2 posiada przyłączony GDP, który wymieniony może być na GTP przez pośrednictwo białka GEF. Ta reakcja jednak zaburzona może być na skutek fosforylacji nieaktywnego eIF2, w którym nie jest możliwa wymiana guanylowego nukleotydu ( GDP/GTP ). Inaczej mówiąc fosforylacja skazuje cząsteczki białka eIF2 na brak ich aktywności.

Elongacja polipeptydowego łańcucha

Po złożeniu cząsteczki rybosomu, czyli przyłączeniu do układu powstałego podjednostki 60S, poprzez odpowiednie tRNA są dostarczane kolejne aminokwasy. Powstały rybosom stopniowo przesuwa się wzdłuż nici mRNA; w oparciu o zasadę komplementarności do nici tej dopasowuje się aminoacylo tRNA. To dopasowanie dotyczy rejonu antykodonu czyli trójki nukleotydów (tRNA) "odpowiadających" kodonowi z mRNA. Zatem z kodonem o sekwencji CAC będzie oddziaływać tRNA posiadający antykodon GUG oraz niosący histydynę.

Do następnego aminokwasu dostarczonego poprzez aminoacylo tRNA w A miejsce rybosomu ulega przyłączeniu za pośrednictwem karboksylowej grupy odczytany wcześniej aminokwas obecny w określonym momencie w P miejscu rybosomu, nadal w formie związanej z tRNA. To oznacza iż jeżeli kodonem pierwszym jest AUG, kolejnym CAC, trzecim z kolei UUU zajdą następujące zmiany w obszarze rybosomu:

1. Do histydyny dostarczonej jako cząsteczki drugiej zgodnie z kolejnością przyłącza się metionina inicjacyjna. Na histydynowym tRNA ( w miejscu A ) wytwarzany jest dipeptyd Met-His oraz ulega przesunięciu w miejsce P.

2. Do fenyloalaniny przyłączonej jako cząsteczki trzeciej karboksylową grupą ulega połączeniu dipeptyd Met-His, powstanie trójpeptyd Met-His-Phe, który przemieszczany jest w miejsce P jak poprzednio.

Ogólny schemat procesu translacji :

Adaptorowa teoria o rozpoznawaniu kodonów .

Wydłużanie się polipeptydowego łańcucha sprowadza się do przyłączania kolejno aminokwasów przy jego C-końcu. Wydłużanie polipeptydowego łańcucha umożliwione jest przez tzw. elongacyjne czynniki m.in. eEF1 oraz eEF1 odpowiadające za zaopatrzenie w aminoacylo tRNA, a także eEF2 odpowiadający za translokację czyli przeniesienie z miejsca A na miejsce P zachodzącą kosztem energii pochodzącej z GTP.

Terminacja

Translacja jest kończona w miejscu, na terenie którego wystąpi jeden wśród trzech terminacyjnych kodonów zwanych kodonami "stop" ( UAG UAA, UGA, ). Wymienione nukleotydowe trójki są rozpoznawane w odróżnieniu od pozostałej części nie poprzez amino-acylo tRNA, lecz poprzez tzw. czynnik uwalniający eRF. Ten czynnik aktywuje enzym który rozcina wiązanie pomiędzy polipeptydem i cząsteczką tRNA, stanowiącą nośnik ostatniego aminokwasu, wynikiem tego jest uwolnienie polipeptydowego łańcucha. To zdarzenie stanowi uwieńczenie szeregu procesów, które obejmuje ekspresja genetycznej informacji.

Podsumowanie:

  1. Translacja ma miejsce w rybosomach - czyli rybonukleoproteinowych strukturach (RNA : białko );
  2. Sygnał początku syntezy cząsteczki białka to kodon AUG, końca syntezy z kolei - jeden spośród kodonów stop - UAG, UAA, UGA;
  3. Synteza białka jest wspomagana przez białkowe czynniki tzw.: elongacyjne, terminacyjne oraz inicjacyjne;
  4. Translacja to energochłonny proces, czerpiący energię pochodzącą z hydrolizy ATP i GTP.