polityk, mąż stanu, humanista, mecenas, kanclerz wielki koronny i hetman wielki koronny. Pochodził z rodziny szlacheckiej, jego ojciec Stanisław był wojewodą bełskim i zagorzałym kalwinem. Jan kształcił się w Krasnymstawie, a następnie w Paryżu, Strasburgu i Padwie, gdzie studiował nauki prawno-historyczne. Został w 1563 r. konsyliarzem nacji polskiej na tym uniwersytecie, a następnie rektorem. Już wtedy wyróżniał się dużą inicjatywą i energią. Po powrocie do kraju zdobył zaufanie Zygmunta Augusta i został jego sekretarzem.
W okresie pierwszego bezkrólewia zyskał popularność wśród szlachty za propagowanie elekcji viritim. Jako zwolennik Henryka Walezjusza uczestniczył w poselstwie do Paryża. W czasie drugiego bezkrólewia zwalczał Habsburgów i zdecydowanie poparł kandydaturę Anny Jagiellonki i Stefana Batorego; został zresztą jego najbliższym doradcą. W 1576 r. został podkanclerzym, a dwa lata później - kanclerzem wielkim koronnym.
Był współtwórcą (wraz z królem) polityki państwa. W czasie wojny z Moskwą zdobył w 1580 r. Wieliż i Zawołocie, a następnie wraz z Batorym - Wielkie Łuki, za co w następnym roku został mianowany hetmanem wielkim koronnym. Prowadził też oblężenie Pskowa.
Zamoyski rozprawił się też z opozycją Zborowskich: wymógł na sądzie sejmowym ścięcie banity Samuela Zborowskiego i skazanie na banicję i konfiskatę dóbr Krzysztofa Zborowskiego za spisek przeciw królowi. Po śmierci pierwszej żony, Krystyny Radziwiłłówny, ożenił się w 1583 r. z Gryzeldą, bratanicą Stefana Batorego.
Po śmierci Batorego Zamoyski po raz drugi sprzeciwił się kandydaturze habsburskiej do tronu polskiego i poparł syna Jana III Wazy i Katarzyny Jagiellonki - Zygmunta III Wazę. W styczniu 1588 r. Zamoyski rozbił pod Byczyną wojska arcyksięcia Maksymiliana Habsburga i wziął go do niewoli. Jednak między Zygmuntem III Wazą a kanclerzem Zamoyskim bardzo szybko doszło do rozdźwięku, gdyż król prowadził prohabsburską politykę zagraniczną, a kanclerz chciał realizować testament polityczny Batorego, którego głównym celem miało być uzależnienie księstw naddunajskich od Korony.
W 1595 r. wspólnie z hetmanem polnym Stanisławem Żółkiewskim zorganizował wyprawę do Mołdawii, gdzie osadził na tronie hospodara Jeremiego Mohyłę, który uznał się polskim lennikiem. Zamoyski odparł też pod Cecorą armię turecko-tatarską, która chciała zmienić ten stan rzeczy. Kiedy w 1599 r. Michał Waleczny w porozumieniu z Turcją próbował połączyć wszystkie państwa naddunajskie, Zamoyski wyruszył w 1600 r. na Wołoszczyznę i rozbił wojska Michała, a na tronie wołoskim osadził Symeona Mohyłę, utrwalając tam wpływy polskie. W latach 1601-02 hetman walczył w Inflantach przeciw Szwedom.
Zamoyski był wielkim protektorem kultury i nauki oraz opiekunem artystów i poetów; jego wesele z Radziwiłłówną uświetniło wystawienie 12 I 1578 r. Odprawy posłów greckich Jana Kochanowskiego, przyjaciela kanclerza. W 1580 r. rozpoczął budowę Zamościa, który został zaprojektowany w stylu renesansowym przez weneckiego architekta Bernarda Morando. W 1594 r. założył w Zamościu akademię, która miała być szkołą polityczną kształcącą dyplomatów. Jednak nie udało się sprowadzić do niej wybitnych uczonych i po śmierci hetmana akademia podupadła. Zamoyski zgromadził spory majątek: posiadał 11 miast i 200 wsi, a ponad trzy razy tyle dzierżawił. Był więc potężnym magnatem o dużych wpływach politycznych, także wśród szlachty. Był zresztą nieformalnym przywódcą magnacko-szlacheckiego obozu popularystów oraz autorem projektów reformy instytucji elekcji.