Mikroskop optyczny

Mikroskop optyczny to urządzenie, które służy do otrzymywania powiększonych obrazów przedmiotów, lub elementów tych przedmiotów, w celu ukazania szczegółów, które nie są widoczne gołym okiem. Powiększenie w mikroskopie optycznym może wynosić nawet 2000 razy. Obraz uzyskany za pomocą mikroskopu, może być obserwowany bezpośrednio poprzez jego okular (tak działa zwykły mikroskop optyczny), może zostać zarejestrowany na kliszy fotograficznej (metoda tzw. mikrofotografii), może być bezpośrednio wyświetlany za pomocą projektora na ekranie (w ten sposób pracuje mikroskop optyczny projekcyjny), lub też przesyłany do odbiornika, w którym to następnie zostaje on wyświetlony (tak działa mikroskop optyczny telewizyjny).

Mikroskop optyczny składa się głównie z następujących elementów:

- kondensator - jest to układ optyczny, którego zadaniem jest oświetlenie badanej próbki

- obiektyw - jest to najczęściej złożony układ optyczny, który powoduje powstanie powiększonego, odwróconego, rzeczywistego obrazu badanej próbki

- okular - układ optyczny powiększający dodatkowo obraz uzyskany za pomocą obiektywu

W mikroskopie optycznym wykorzystywane są różnego rodzaje obiektywów. Jednym z nich jest obiektyw zwierciadlany. Jego zastosowanie pozwala przede wszystkim na zwiększenie odległości przedmiotu od obiektywu, dzięki czemu jest więcej przestrzeni na umieszczenie w mikroskopie dodatkowych elementów, takich jak komory grzejne, czy chłodzące, lub też tzw. mikromanipulatory. Najważniejsze parametry charakteryzujące mikroskop to powiększenie, oraz zdolność rozdzielcza. Maksymalna wartość powiększenia, które może być użyteczne dla obserwatora, określa zdolność rozdzielcza. Z kolei zdolność rozdzielcza jest ograniczona przez dyfrakcję światła, zależy także od wielkości apretury (im większa, tym większa zdolność rozdzielcza), oraz od długości fali (im mniejsza tym większa zdolność rozdzielcza). Obecne mikroskopy optyczne, oprócz tego, że pozwalają na obserwację przedmiotów w świetle widzialnym, to także umożliwiają wykorzystanie do tego celu innych rodzajów promieniowania. Istnieją mikroskopy, które rejestrują obraz w podczerwieni, czy ultrafiolecie. W przypadku tych dwóch ostatnich rodzajach promieniowania, obraz uzyskany za pomocą mikroskopu jest odpowiednio przetwarzany, za pomocą specjalnych konwerterów. Istnieje także wiele metod obserwacji preparatów, chociaż najpopularniejsze są metody jasnego i ciemnego pola, oraz metoda kontrastu fazowego. W metodzie jasnego pola obserwuje się cząstki pochłaniające lub rozpraszające światło i wykorzystuje się tutaj fakt, że cząstka taka daje ciemny obraz na jasnym tle. W metodzie ciemnego pola wykorzystuje się to, że do obiektywu trafiają, tylko promienie, które zostały rozproszone na przedmiocie. Natomiast w metodzie kontrastu fazowego, która to jest wykorzystywana do obserwacji przedmiotów przezroczystych, wykorzystuje się różnice współczynnika załamania jaki posiada przedmiot względem ośrodka w którym się on znajduje.

Pierwszy mikroskop optyczny powstał najprawdopodobniej w 1590 roku i został zbudowany przez Z. van Jansena. W 1872 roku opracowano podstawy teoretyczne opisujące działania mikroskopu. Od tego czasu wiele się zmieniło w konstrukcji mikroskopu. Postęp technologiczny, modyfikacje konstrukcji i wykorzystanie wielu dodatkowych urządzeń, umożliwiają obserwowanie przedmiotów za pomocą światła przechodzącego przez niego, jak i od niego odbitego, oraz umożliwiają wykorzystanie mikroskopu także do specjalnego rodzaju zadań. Między innymi w dzisiejszych czasach dzięki mikroskopowi, jesteśmy w stanie poznać strukturę przedmiotów anizotropowych (do tego celu wykorzystuje się mikroskop polaryzacyjny), prowadzić obserwacje stereoskopowe (przy użyciu mikroskopu optycznego spektroskopowego), czy nawet prowadzić obserwacje cząsteczek, których rozmiary są mniejsze od zdolności rozdzielczej mikroskopu (tutaj stosuje się tzw. ultramikroskop). Gdy skonstruowano pierwsze lasery, powstały także pierwsze mikroskopy, które je wykorzystywały. Dzięki laserom skonstruowano mikroskopy skanujące, odbiciowe i fluoroscencyjne, czy mikroskopy dopplerowskie, oraz inne. W 1931 roku powstał pierwszy mikroskop elektronowy, a skonstruował go Ernst Ruska, dzięki czemu zrewolucjonizował w ten sposób biologię. Bowiem dzięki temu mikroskopowi stało się możliwe oglądanie obiektów, których rozmiary były rzędu nanometrów. Ernst Ruska za skonstruowanie mikroskopu elektronowego został uhonorowany w 1986 roku Nagrodą Nobla.

Konstrukcja mikroskopu optycznego to w zasadzie połączenie dwóch mechanizmów: optycznego i mechanicznego. Układ mechaniczny służy do ustawiania położenia odpowiednich elementów układu optycznego, natomiast sam układ optyczny służy do uzyskania powiększonego obrazu badanego obiektu. Układ mechaniczny spełnia ważną rolę, ponieważ zapełnia stabilność całemu urządzeniu, ustawia wszystkie elementy tak, aby uzyskać wyraźny i ostry obraz, wyposażony jest w różnego rodzaju elementy regulujące.

W skład układu mechanicznego wchodzą:

Korpus mikroskopu i statyw - jego głównym zadaniem jest zapewnienie całemu układowi stabilności i sztywności, więc panuje tutaj zasada, że im jest on cięższy i sztywniejszy tym lepiej. Od konstrukcji statywu zależy, czy dla ustawienia ostrości, czyli określenia odpowiedniej odległości pomiędzy obiektywem, a badanym obiektem, regulujemy położenie stolika przedmiotowego, czy też może sterujemy położeniem tubusa zawierającego obiektyw. Rozwiązanie pierwsze jest lepsze, z tego względu, że zapewnia także stałą wysokość okularów. Dlatego też jest ono stosowane w nowszych mikroskopach. Poza tym drugie rozwiązanie, czyli dotyczące poruszającego się tubusa, ma tą istotną wadę, że w przypadku cięższych układów optycznych jego ustawienie może nastręczać kłopotów. Może tutaj pojawić się tzw. płynięcie tubusa, czyli powolne opadanie w czasie regulacji. W wyniku tego rodzajów problemów zrezygnowano już z tego rozwiązania i obecnie w produkowanych mikroskopach stosuje się ten pierwszy wariant, czyli regulacje stolika przedmiotowego.

Stolik przedmiotowy - jest to element, który służy do umieszczenia na nim badanego preparatu i możliwości jego przesuwania w płaszczyźnie stolika. Jak już wcześniej wspomnieliśmy, w zależności od rozwiązania konstrukcyjnego zastosowanego w mikroskopie, stolik ten może się przesuwać w pionie, zmieniając w ten sposób odległość przedmiotu od obiektywu, lub być nieruchomy. W nowoczesnych mikroskopach stosuje się stoliki, które mają szczególne przeznaczenie, tak jest w przypadku mikroskopu polaryzacyjnego, gdzie stosuje się stolik obrotowy.

Śruba mikrometryczna i makrometryczna - są to śruby pozwalające na regulację odległości przedmiotu od obiektywu, czyli ustawienie ostrości obrazu przedmiotu. W zależności od konstrukcji mikroskopu ich obrót może powodować opuszczanie i podnoszenie stolika, lub przemieszczenie tubusu wraz z całym układem obiektyw - okular. W starszych mikroskopach zmiana obiektywu wymaga ponownej regulacji ostrości za pomocą śrub. W nowszych natomiast mikroskopach (produkowanych od połowy XX wieku) występuje tzw. układ parafokalny, który powoduje to, że raz nastawiona ostrość obrazu dla danego obiektywu, pozostanie taka sama, nawet przy zmianie na inny obiektyw (co najwyżej może być wymagana niewielka korekta ostrości).

Rewolwer - jest to obrotowa tarcza, zaopatrzona w gniazda, w których to znajdują się obiektywy. Obrót rewolwera pozwala na bardzo łatwą zmianę obiektywu, czyli także powiększenia mikroskopu.

Tubus - jest to przestrzeń znajdująca się pomiędzy obiektywem mikroskopu, a jego okularem. W niej to powstaje obraz utworzony przez obiektyw. W mikroskopach produkowanych w dawnych czasach wykorzystywano tubusy o standardowej długości 160 mm, lub 170 mm. Wiązało się to z koniecznością stosowania odpowiednich obiektywów pod każdą z tych długości (na obiektywie grawerowano długość do jakiej był on przystosowany). Natomiast w mikroskopach, które produkowano w końcu XX wieku i które teraz się produkuje stosuje się tzw. optykę ustawioną na nieskończoność, bowiem istnieje możliwość produkcji obiektywów ustawionych na nieskończoność (obiektywy takie zamiast wartości długości mają wygrawerowany na sobie symbol nieskończoności.

Kondensator - w najprostszym przypadku jest to zwykłe lusterko, które pozwala na odpowiednie skierowanie światła. W mikroskopach bardziej skomplikowanych kondensator stanowi odpowiednia lampa, wyposażona jest w kolektor, oraz układ którym można regulować różne jej parametry. Odpowiednie oświetlenie preparatu jest sprawą kluczową dla obserwacji.

Układ mechaniczny kondensatora - jest to układ umożliwiający zmianę przesuwanie kondensatora w pionie. W bardziej nowoczesnych mikroskopach kondensator może także być centrowany względem osi optycznej mikroskopu.

W skład układu optycznego wchodzą:

Oświetlacz - w najprostszym przypadku jest to zwykłe lusterko, które pozwala na odpowiednie skierowanie światła. W mikroskopach bardziej skomplikowanych kondensator stanowi odpowiednia lampa, wyposażona jest w kolektor, oraz układ, którym można regulować różne jej parametry. Odpowiednie oświetlenie preparatu jest sprawą kluczową dla obserwacji.

Obiektyw - jest to układ optyczny, który zbiera światło pochodzące od przedmiotu i tworzy jego powiększony obraz wewnątrz tubusu

Nasadka okularowa - jest to element, w którym osadzone są okulary, pozwalający na zmianę biegu promieni świetlnych, tak, aby zapewnić wygodę obserwacji. W prostszych mikroskopach mamy do czynienia z nasadami zaopatrzonymi w jeden okular. Natomiast w bardziej zaawansowanych stosuje się nakładki z dwom okularami - tzw. nakładki binokularne. Pozwala to na obserwowanie obrazu przedmiotu przy pomocy obu oczu. Jest to rozwiązanie bardziej korzystne, jeśli chodzi o wygodę obserwacji, ale i także zdrowie obserwatora. Często nasadki binokularne są dodatkowo zaopatrzone w układ pozwalający na regulację ich rozstawu, dzięki czemu możliwe jest odpowiednie dopasowanie okularu do oczu, a także w układ regulujący dioptrię dla jednego z okularów, dzięki czemu możliwe jest wyrównanie różnic ostrości, jakie występują pomiędzy oczami obserwatora. Co więcej taki okular może być podłączony do aparatu fotograficznego, zwykłego lub cyfrowego, a nawet do kamery.

Okular - jest to układ optyczny, który służy do powiększania i obserwacji obrazu utworzonego przez obiektyw mikroskopu. Okular może także w pewien sposób korygować wady obrazu wytworzone przez obiektyw.

Mikroskop optyczny:

A - okular,

B - śruba mikrometryczna,

C - śruba mikrometryczna,

D - obiektyw bagnetowy(wymienny),

E - płytka szklana z badaną próbką,

F - blaszki mocujące próbkę,

G - lusterko,

H - pokrętło nastawne lusterka,

I - korpus,

J - podstawa.

Mikroskop polaryzacyjny

Jest to mikroskop, który przystosowany jest do obserwacji preparatów w świetle spolaryzowanym liniowo. Wykorzystywany jest on głównie do badania anizotropowości obiektów. Oprócz klasycznych elementów mikroskopu, w polaryzacyjnym występuje jeszcze dodatkowo polaryzator, analizator, oraz soczewka Bertranda. Polaryzator jak sama nazwa wskazuje, służy do polaryzacji światła, analizator natomiast do sprawdzenia polaryzacji światła. Soczewka Bertranda jest to soczewka, której użycie powoduje to, że w okularze nie obserwujemy obrazy preparatu, a jedynie obraz źrenicy obiektywu. Gdy nie ma preparatu na stoliku, to skrzyżowanie polaryzatora i analizatora spowoduje powstanie w źrenicy obiektywu obrazu przedstawiającego czarny krzyż tzw. konoskopowy. Gdy natomiast umieścimy na stoliku preparat, to krzyż ten zostanie zmodyfikowany i utworzy się figura charakterystyczna dla danego typu anizotopowości jaka występuje w preparacie. W przypadku gdy obserwujemy pod takim mikroskopem jedno lub dwuosiowy kryształ, to powstały obraz, oprócz krzyża może także przedstawiać barwne prążki, a także pewne figury interferencyjne, które są określane mianem obrazów konoskopowych. Do analizy takich obrazów wykorzystuje się zazwyczaj płytki opóźniające, takie jak np. ćwierćfalówka, lub też dwójłomne kompensatory.

Pierwszy mikroskop polaryzacyjny został skonstruowany w 1834 roku, przez Tabolta i Brewstera i był wówczas wykorzystany do badania minerałów. Obecnie mikroskopy polaryzacyjne wykorzystywane są w biologii, gdzie bada się nimi strukturę komórek i tkanek, a także w metalografii, czy przemyśle szklarskim i włókienniczym.

Mikroskop elektronowy skaningowy - SEM (Scanning Elektron Microscope)

Jest to specyficzny rodzaj mikroskopu elektronowego. W mikroskopie tym tworzy się wiązkę elektronów, którą następnie skupia się na powierzchni badanej próbki w ten sposób, że średnica tej wiązki w punkcie na powierzchni ma średnicę wynoszącą ok. 0,1 nm. Tak utworzona wiązka następnie przemiata wybrany prostokąt powierzchni przemiatając - skanując go linia po linii. Wiązka elektronów powstaje w wyniku działania działka elektronowego. Elektrony emitowane z niego są następnie przyśpieszane w polu elektrycznym, którego potencjał może wynosić 0,1 - 30 kV. Rozpędzone elektrony są następnie skupiane przez odpowiednie soczewki elektromagnetyczne. Natomiast skanowanie odbywa się za pomocą cewek, które powodują określone odchylenie wiązki. Elektrony padające na powierzchnię badanej próbki, wnikają do niej na niewielką głębokość. Część z nich zostaje wychodzi z powrotem, ulegając wstecznemu rozproszeniu, jednak większość z nich po wniknięciu do próbki pozostaje w niej. Elektrony które pozostały w próbce, tracą stopniowo swoją energię w wyniku różnego rodzaju oddziaływań. Oddziaływaniom tym towarzyszy emisja promieniowania rentgenowskiego, wtórnych elektronów Augera, czy promieniowania widzialnego. To emitowane promieniowanie można zarejestrować za pomocą odpowiednich detektorów, a sygnał z tych detektorów może posłużyć do stworzenia obrazu powierzchni badanej próbki. Obraz ten jest wyświetlany na monitorze, w który zaopatrzony jest każdy taki mikroskop. Obecnie najczęściej do stworzenia takiego obrazu wykorzystuje się emisję wtórnych elektronów Augera. Elektrony takie, po wyjściu z próbki, oraz elektrony wstecznie rozproszone padają następnie na detektor, który to daje odpowiedni sygnał elektryczny. Sygnał ten z kolei steruje jasnością wiązki elektronów, która to pada na kineskop monitora obrazowującego, poruszając nią synchronicznie z wiązką badającą powierzchnię próbki. Tak więc obraz próbki powstaje w sposób czysto elektroniczny, bez zastosowania jakichkolwiek układów optycznych do obserwacji. Powstały obraz stanowi swego rodzaju mapę intensywności emitowanych elektronów przez próbkę. Szczegóły powierzchni mogą być obserwowalne, ponieważ intensywność ta zmienia się wraz z nierównościami powierzchni, czy różnym składem chemicznym jej elementów. Oprócz obrazowania za pomocą wtórnych elektronów można także obrazować za pomocą emitowanego promieniowania rentgenowskiego. Wtedy to detektor wtórnych elektronów Augera, zastępuje detektor promieniowania rentgenowskiego, który to jest sprzężony ze spektrometrem rentgenowskim, który umożliwia utworzenie widm energetycznych dla całej powierzchni badanej próbki. Dzięki temu możliwe jest dokładne poznanie jej struktury chemicznej.

Powiększenie skaningowego mikroskopu elektronowego określa stosunek rozmiaru monitora obrazowującego do wielkości powierzchni badanej próbki, w dzisiejszych mikroskopach osiąga ono wartości rzędy setek tysięcy. Jeśli chodzi o zdolność rozdzielczą tego typu mikroskopu, to w najnowszych konstrukcjach może osiąga ona nawet 1 nm. Kolejną zaletą mikroskopów SEM, jest to, że charakteryzują się bardzo dobrą ostrością, przez co idealnie się sprawdzają do badań powierzchni o nieregularnych kształtach. Od momentu skonstruowania pierwszych mikroskopów tego typu, znalazły one szerokie zastosowanie w praktycznie każdej dziedzinie nauki, tam gdzie potrzebne jest dokładne poznanie struktury powierzchni. Sam pomysł zbudowania mikroskopu skaningowego elektronowego pojawił się już w roku 1938, jednak w wyniku ograniczeń technologicznych został on skonstruowany dopiero w latach 60 ubiegłego wieku.

Mikroskop skaningowy sił atomowych

Mikroskop ten w zasadzie charakteryzuje się prostą ideą działania. Jednak w wyniku braku odpowiedniej technologii został on skonstruowany stosunkowo niedawno. A powstał on w laboratoriach firmy IBM. Otóż zasadę jego działania można porównać do działania gramofonu, jaki to odtwarzał płyty winylowe. W gramofonie tym odtwarzanie płyty odbywało się za pomocą przesuwania odpowiedniej igły po jej powierzchni. Tutaj sytuacja jest bardzo podobna. Po badanej powierzchni przemieszcza się delikatne ostrze, które to jest zamocowane na niewielkiej sprężynce. Gdy ostrze to przemieszcza się ponad powierzchnią próbki, to jego atomy oddziałują z atomami próbki, przez co na ostrze działa pewna siła. Siła ta powoduje ugięcie się sprężynki, które opisuje w prosty sposób prawo Hooke'a F = - kx. We wzorze tym F oznacza działającą siłę na sprężynę, x jej odkształcenie, a k stałą sprężystości. Tak więc w czasie przemieszczania się ostrza po powierzchni próbki, wykorzystując wartość odkształcenia sprężynki, którą w dzisiejszych czasach można mierzyć z dokładnością do odległości rzędu rozmiarów atomu, oblicza się siłę jaka działa na sprężynkę. Dzięki temu wiadomo w jakiej odległości od ostrza znajdują się atomy powierzchni, a to z kolei pozwala na dokładne odwzorowanie jej struktury. Poznanie dokładnej, na poziomie atomowym struktury powierzchni pozwala na określenie jej wszelkich właściwości, takich jak podatność na tarcie, w jaki sposób jest rozłożony na niej ładunek elektrostatyczny, czy jaka wyglądają jej domeny magnetyczne. Mikroskop skaningowy sił atomowych otwiera zupełnie nowe możliwości badania w biologii. Bowiem w odróżnieniu od mikroskopu skaningowego, elektronowego nie wymaga umieszczania badanej próbki w próżni. Dzięki czemu możliwe staje się badanie komórek żywych i do tego w ich naturalnym środowisku, co umożliwia zastosowanie odpowiedniej przystawki do mikroskopu, tzw. komory cieczowej. Jeden z takich mikroskopów skonstruowano w Instytucie Fizyki Jądrowej, gdzie wykorzystuje się go głównie do badań powierzchni materiałów, a także do badań biologicznych, związanych do określania właściwości mechanicznych żywych komórek - ich elastyczności i adhezji. Ostatni obszar badań, ma ogromne znaczenie dla medycyny, ponieważ dzięki temu możliwe stanie się poznanie procesów biologicznych, jakie zachodzą we wnętrzu komórek w skali subkomórkowej.